近年來，由于細胞治療方法的興起，人們日益需求能夠高質量、穩健、有效進行細胞表征測定的方法。細胞計數，作為細胞療法中最基礎的檢測項目，現今需要更高的檢測可信度。2017年4月，美國國家標準與技術研究院（NIST）&食品與藥物管理局（FDA）共同舉辦了一場專注于細胞計數的研討會，聚焦于選擇、設計和驗證細胞計數方法，以及如何得到充分的計量保證。近50位來自于工業界、學術界和政府監管機構的專家參與了研討會。Nexcelom Bioscience作為為數不多的受邀細胞計數設備制造商之一列席參加了本次會議，與業界專家們共同討論細胞治療中關于細胞計數的各種問題。本文總結了此次會議的討論重點。
研討會的總體主題：我們需要根據細胞樣品的屬性，細胞計數的目的和要求，來選擇適合目的（fit-for purpose）的測量方法。例如，藥物篩選和細胞治療產品生產與放行過程中的細胞計數要求會有顯著不同。Fit-for purpose是指選擇的方法是否適合細胞計數的預期目的。理想的適用性需要滿足兩方面的要求，一是能解決生物學問題，二是獲得的數據質量（靈敏度、精密度、準確度）足夠好，足以支持下游決策。一個更標準化的設計、限定和驗證符合fit-for purpose原則的細胞計數方法的流程，將加速產品的開發和轉化。
研討會上討論的主要內容：
細胞計數測量過程
細胞計數遵循相同的常規步驟：（i）樣品準備，（ii）手工計數或使用儀器設備的自動計數，（iii）數據分析（如圖1）。
Figure 1. General cell counting measurement process (Adapted from Lin-Gibson et al. Bioinsights, 2016).
測量過程中的很多方面都可能給結果帶來顯著的可變性。此外作為測量過程中“輸入”的細胞樣品，屬性可能會有大范圍的波動，也會給計數結果帶來顯著的可變性。細胞樣品本身就很復雜，具有一系列穩定或者變化的性質 - 樣品配方（如培養基組分）、成分（如不同細胞類型和功能）和固有的生物學可變性（如供體變化和細胞狀態）。認識到細胞計數過程和細胞樣品相關的各種影響因素，研討會上專家們討論了提高細胞計數可信度的策略。
從監管角度看細胞計數
Figure 2. Analytical method development flow diagram through stages of
cell-based product development and regulatory approval. For the purpose
of this figure, the following definitions apply: assay qualification,
determining if an assay is suitable for its intended purpose; assay
validation, assuring that the assay is suitable to its intended purpose
on a routine basis. (Courtesy of Steven Bauer, FDA)
FDA的與會人員強調了細胞計數對于檢測細胞治療產品質量（如屬性、純度、效價和劑量）的重要性。他們重申基于不同目的，最適合的細胞計數方法可能不同，這主要取決于細胞治療產品本身。他們進一步指出，雖然在獲得許可證之前，細胞計數等試驗方法不需要進行驗證；但越早建立高可信度的方法，越有利于產品轉化（圖2）。FDA與會人員特別指出：確定適當的細胞計數方法，了解可用的儀器，有助于共識性文件標準的制定和參考樣品的開發，有利于解決再生醫學療法中細胞計數方面的挑戰。
建立細胞計數方面的質量屬性
細胞治療產品的質量屬性可通過測定相關的、可測量的生物學指標來評估。許多質量屬性直接（如總細胞濃度、活細胞濃度）或間接（如使用細胞濃度歸一化處理的活力數據）使用細胞計數結果獲得數據。選擇細胞計數方法時，要明確理解測量對象和預期質量屬性之間的關系（如活細胞濃度、存活率百分比）。
例如活細胞濃度是一種差異細胞計數，需要將活細胞與死細胞區分開，與細胞類型無關。活細胞濃度又可以進一步分解成兩個屬性組成：活細胞數和樣品體積。
測定活細胞數時，很多生物學指標可以用來區分活細胞和死細胞。這些生物學指標包括細胞膜完整性、代謝活力和細胞復制能力。生物學指標可以通過不同測試方法測定，且每種測試方法都有不同的測量對象。例如臺盼藍排除和DAPI核酸染色法都可以通過測試細胞膜完整性來區分活細胞和死細胞。對同一個生物學指標的類似檢測，不同染料（大小、親和力不同）對細胞膜滲透性的固有不同和顯示信號（比色或者熒光）的不同，也會導致結果上的差異。
另一個屬性組成是樣品的體積。體積可以通過校準過的儀器來獲得（例如已測定的計數室尺寸）：間接方法如同時用基于流式原理的方法測定已知濃度的微珠；或者通過流量計等方法直接測定。體積測定偏差將導致結果偏差，降低活細胞濃度測定結果精密度。另外在測試活細胞濃度時，儀器與儀器之間結果的差異，有些情況下可能是因為儀器體積校準之間的差異造成的。
總的來說，應選擇反映預期測量目的的生物學指標；當應用這些生物學指標時，能夠反映細胞治療產品的作用機理。此外，測量目標應盡可能與生物學指標直接相關。專家強調需要了解細胞計數的生物學基礎，特別是當某個細胞亞群被認為與生物學或臨床結果相關時的差異細胞計數。
選擇與設計細胞計數方法
自18世紀以來，使用血球計數板進行手工計數一直被認為是細胞計數的金標準。研討會的參會人員表示這種觀點現在依然存在。手工計數非常費時，并且誤差很大，會給產品開發和生產帶來很多問題。隨著技術的發展，現在許多基于自動成像和流式原理的方法被用來進行總細胞和亞細胞群計數。可選的方法很多，樣品類型以及細胞計數目的也各不相同。
細胞計數檢測過程的考慮因素大致上可以分為：（i）生物學相關因素；（ii）測量特性相關因素，包括計量保證策略；（iii）合規性及其他實際因素。生物學相關因素是指計數方法基于生物學指標獲得細胞數量的能力。分析方法的測量特性相關因素包括計數方法提供足夠特異、精密和穩健數據的能力；控制測量過程中的可變性并確保過程中的可信度的能力也是需要的；另一個需要重點考慮的因素是方法在產品研發管線各個環節中的轉化能力。理想情況下，研發過程中使用的細胞計數方法應該能夠應用到生產甚至放行中。細胞計數系統需要盡量少的可變因素和校準要求，最好內置自控系統。緊接下來需要考慮的就是合規性，包括是否滿足GMP （Good Manufacturing Practice）要求。如果不止使用一種計數方法，或者在不同地點使用同一種方法，需要考慮方法之間的可比性。其他需要考慮的實際因素包括：用量、價格、所需時間以及培訓。一個特別需要指出的挑戰是計數方法能夠允許使用者自行修改調整的程度。儀器提供越多的微調設置，將提供更大的靈活性和可優化性；另一方面，增加儀器的靈活性意味著需要更多的培訓，以及在生產中做更多記錄。
實驗設計（DOE）在優化細胞計數流程中的應用
一旦細胞計數的目的和大致方法已經確定，建議使用“實驗設計（Design of Experiments ，DOE）來進行方法優化和穩健性測試。
專家指出很多因素影響了細胞計數實驗。這些因素包括準備細胞樣品時使用的稀釋液。稀釋液可能影響樣品的穩定性，引入或者減少影響計數的碎片或雜質。儀器與儀器之間的差異也是一個挑戰，需要使用更穩健的體積校準策略來改進，例如使用已知濃度的微珠或其他體積校準方法。很多因素會影響細胞計數方法，精心設計的DOE有助于理解每個因素的作用以及各個因素在細胞計數過程中的聯系。
細胞計數驗證
基于現有的經驗，很多參會者推薦了國際人類用藥物技術要求協調理事會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于細胞計數方法驗證。ICH傳統上專注于藥物制造，而不是細胞治療產品。指南中描述了準確度、精密度、特異性、檢測限、定量限、線性、范圍和穩健性的概念。這個通用的驗證框架在很大程度上適用于細胞的分析測量，但對于細胞治療產品要做出一些針對性的調整。
受限于動態、復雜，有時數量還有限的樣品，需要對驗證步驟進行改變，或者增加額外的考量。例如在考察細胞計數中間精密度（不同操作者、不同儀器、不同日期、不同批次之間的差異）時，實驗設計時需要考慮整個周期中樣品的穩定性，尤其需要考慮可能影響細胞計數的樣品性質（如細胞活率、細胞聚集、碎片和氣泡形成等）。
Figure 3. Acceptability of cell counting measurements. Typical cell counting measurements are evaluated and optimized for precision, however, due to the lack of appropriate reference materials, accuracy is not always well understood.
準確度對細胞計數來說，是個獨特的挑戰。理想的細胞計數計數結果應該既精密又準確。細胞計數的精密度可以通過實驗確定。但因為缺少合適的參考樣品和對照方法，細胞計數的準確度很難獲得。
評估準確度一般是通過對比測定結果與具有參考值和已知不確定性的恰當參考樣品的檢測結果，或者通過與對照方法進行比較。因為細胞計數測定缺少通用的參考樣品，基于人工顯微鏡觀察計數的“金標準”也具有很大的偏差和不精密性，通過上述方法檢測準確度不能滿足細胞治療產品對準確度的要求。
為了滿足工業界的需要，NIST近期開發出了在沒有合適對照方法和樣品的情況下，評估細胞計數方法的策略。這些方法通過系列稀釋試驗設計，評估了細胞計數方法的精密度和比例性。在這樣的實驗設計中，細胞計數結果對梯度稀釋的比例響應作為評價計數質量的內部基準【2】。這個過程不受測定方法和細胞類型的影響，提供了不依賴于“金標準”方法或參考樣品比較，就可以評估細胞計數方法質量的途徑。這個策略的目標就是解決細胞治療產品生產者在細胞計數方法轉型或者選擇“fit for purpose”計數方法時遇到的挑戰。
細胞計數的生物或非生物參考樣品及內參
合適的參考樣品將極大的有助于對細胞計數準確度的評估，有利于對細胞計數方法之間進行比較。因此，研討會討論中很重要的一部分就集中在現今細胞計數參考樣品的使用和參考樣品的需求上。會上達成了一個重要共識：使用者需要理解各種參考樣品在計數過程中的作用。細胞治療從業者需要優化的或者新的參考樣品來評估細胞計數的準確度。會上討論了生物的（基于細胞）和非生物的（主要是微珠）參考樣品的作用。有人指出針對測定過程的特定方面需要選擇合適的參考樣品，且不應在其預期使用目的之外進行過度解讀。
細胞計數計量保證策略
為了保證測量結果的質量，需要使用基于計量科學原則的計量保證策略。理想的測量結果由以下3點構成：（i）以常用單位表示的數值，（ii）測量不確定度，（iii）可以保證測量結果質量的證據。對細胞計數來說，了解測量過程是否會以及何時會達不到標準很重要。在這種情況下，需要設計計量保證策略以提供足夠的證據來監測測量過程的質量，提供計數結果是否可靠的指示。測量保證的證據通常以測量過程中的中間測量形式出現，在整個測量過程中的特定點建立可信度。測量保證策略可以每年或每季度不定期實施，通過驗證和SOP作為質量保證計劃的一部分。儀器驗證步驟等其他策略可以為每天的測量提供保證；或者與每次測量同時進行，以提供每個測量值的可信度。
Figure 4. Example of a hypothetical cell counting measurement with in-measurement-process controls to provide evidence that the user should have confidence in the value obtained by the measurement process. Spec, specification; LOD, limit of detection.
當計量保證策略應用到每次測量中時，它們作為測量步驟中的控制環節，為測量過程提供同時驗證。這種策略在長期記錄和監測一種分析方法時非常有效，并能夠識別方法中的偏移和錯誤。很多測量步驟中的控制環節可以直接使用細胞計數的數據，或者通過使用測試樣品即可進行的簡單實驗來完成。這樣的設計策略具有實際可操作性。例如，細胞計數結果是單位體積的細胞數；在使用細胞計數值做出決策之前我們有幾個假設。這些假設包括：（i）細胞是懸浮于介質中的單個物體，（ii）所有目標細胞都被計數了，而其他的都被排除了，（iii）已知體積已經被驗證過，（iv）試劑和儀器工作正常，（v）檢測結果在線性范圍內，在檢出限以上，在飽和限以下。在測量時需要收集證明以上假設是可信的證據。例如，需要設置對照試驗和數據分析策略，在試劑出現問題、細胞過度聚集、流路堵塞、儀器狀態改變或預設體積錯誤時提醒使用者。當設置了合適的測量步驟中的控制環節，細胞計數測定過程的質量才能獲得保證（圖4）。
總結：
本次細胞計數研討會的一個關鍵結論就是：獲得高質量細胞計數結果的方法并不是單一的。使用者必須要考慮細胞計數的目的，設計最合適的方法和計量保證策略。人們需要開發、鑒定和驗證細胞計數方法的通用策略和原則，這些前期的努力會決定后期標準化的考慮和努力方向。關于細胞計數的建議包括：（i）文件標準和最佳實踐指南，（ii）一致的術語，以實現共同理解和清晰的溝通，（iii）生物以及非生物參考樣品以提升計量保證，（iv）有別于“one-size fits all”觀念的，基于“fit-for-purpose”原則的個體化檢測策略。
[1] ICH. Validation of analytical procedures: text and methodology. In:
Secretariat I, editor. ICH HarmonisedTripartite Guideline. Geneva,
Switzerland: ICH; 2005.
[2] Sarkar S, Lund SP, Vyzasatya R, Vanguri P, Elliott JT, Plant AL, et
al. Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a
dilution series experimental design. Cytotherapy 2017;19:1509–21.