血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其間的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后，蛋白質部分濃縮，散布不均，應充沛混勻宜輕緩，防止氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上激烈振蕩。混濁或有沉積的血清標本應先離心或過濾，弄清后再檢測。重復凍融會使抗體效價下跌，所以測抗體的血清標本如需保存作屢次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自收集時就應注意無菌操作，也可參加恰當防腐劑。
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其間某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均平等于血清。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固收縮后即可獲得。除特殊情況外，在醫學查驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可平等使用。血清標本可按常規辦法收集，應注意防止溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。