ELISA檢測噬菌體抗體與目的抗原的親和力

【材料和試劑】
（1）酶標板
（2）酶標儀
（3）0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)
（4）1％A
（5）HRP標記的抗M13噬菌體多抗
（6）2mol/L H2SO4
【操作步驟】
(1)將抗原用或0.5mol/L Na2CO3(pH9.6)稀釋至10μg/ml;
(2)對于要檢測的每個克隆,至少包被2個孔,每孔用200μl稀釋抗原。同時包被陰性對照抗原。此外,包被陽性對照抗原,陽性對照抗原用anti-M13抗體;
(3)室溫包被1～2h,最好于4℃過夜包被,甩掉孔中液體,倒置于紙巾上空干。
(4)每孔中用至少200μl 1％A封閉,37℃1h。去掉液體后空干。
(5)將重組噬菌體事先用等體積的封閉液于室溫下封閉15min～30min,以封閉各種蛋白質之間的非特異性結合位點。
以M13噬菌體作為陽性對照噬菌體,也按上述步驟操作。
(6)在每個包被抗原孔中,加入稀釋的重組噬菌體懸液200μl,37℃ 1～2h。在包被了陽性對照抗原的孔中,加入200μl陽性對照噬菌體。
(7)去掉孔中液體,倒置于紙巾上。將板浸入/0.5％ Tween20(T)中,振蕩趕走氣泡,將板取出。重復洗滌５遍。
(8)將板倒置于紙巾上,去掉所有液體。
(9)將HRP酶標的Anti-M13抗體用封閉緩沖液稀釋至合適濃度。
(10)在每孔中加入200μl HRP/Anti-M13稀釋液。
(11)37℃溫育1h。按前述方法洗滌6次。
(12)每21ml 1×ABTS底物溶液中加入36μl 30％ H2O2。在每孔中加入200μl。
(13)置室溫20～60min,直至出現適中的顏色反應。加入2mol/L H2SO4終止反應。
(14)于415nm波長下用酶標儀讀出光吸收值。良好的數據中,噬菌體抗體與篩選抗原的吸收值應當比陰性對照抗原的吸收值高2～3倍。
從Pharmacia公司可以購買用于檢測噬菌體抗體的試劑盒,也可以制備抗M13噬菌體的多抗。關于噬菌體抗體的檢測,也可以采取其他方法,應當根據實際情況而定。