實驗概要
掌握ELISA樣品制備的基本方法。
主要試劑
1. 細胞/組織提取緩沖液配方
1) 100 mM Tris, pH 7.4
2) 150 mM NaCl
3) 1 mM EGTA
4) 1 mM EDTA
5) 1% Triton X-100
6) 0.5% 脫氧膽酸鈉
2. 制備完全提取緩沖液所需的其它試劑
1) 磷酸酶抑制劑混合物
2) 蛋白酶抑制劑混合物
3) PMSF
注意：使用前，用如制造商所述的磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物以及 PMSF 將細胞提取緩沖液補充至 1mM。
實驗步驟
1. 細胞培養物上清液
將細胞培養基移至離心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。立即等分上清液并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
2. 細胞提取物
1) 將組織培養板放置在冰上
2) 吸出培養基并且用冰冷的 PBS 輕輕洗滌細胞一次
3) 吸出 PBS 并且每 100 mm 培養板添加 0.5 ml 完全提取緩沖液
4) 剝離細胞，收集在傾斜板中，然后移至預冷管中
5) 短暫渦旋并在冰上孵育 15-30 分鐘
6) 在 4℃下以 13,000 x rpm 離心 10 分鐘，沉淀不溶性內容物
7) 將上清液（這里是指可溶性細胞提取物）等分至冰上干凈的冷卻管，然后在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
3. 條件培養基
將細胞接種到完全（含血清）生長培養基中，使細胞增殖到所需匯合度。棄去生長培養基并用幾毫升溫熱 PBS 小心洗滌。重復洗滌步驟。棄去最后的 PBS 洗滌液并小心添加無血清生長培養基。孵育 1-2 天。將培養基移取至離心管，并在 4℃下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。立即等分上清液并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
4. 奶乳
收集樣品并在 4℃下以 10,000xg 離心 2 分鐘。等分上清液并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
5. 血漿
將全血收集到含抗凝血劑的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目錄號：363080/363080）或添加 0.1M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。在 4℃下以 3000 rpm 離心 10 分鐘。立即等分上清液（血漿）并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
6. 尿液
收集樣品并在 4℃下以 10,000xg 離心 2 分鐘。等分上清液并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
7. 唾液
收集樣品并在 4℃下以 10,000xg 離心 2 分鐘。等分上清液并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
8. 血清
將全血收集到未經處理的測試管中，或者如不含抗凝血劑的管，例如 BD 血清用真空采血管（目錄號：367812）。在室溫下不受干擾地孵育 20 分鐘。在 4℃下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。立即等分上清液（血清）并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
9. 組織提取物
1) 用干凈的工具切割所關注的組織，最好在冰上進行，并應盡可能快以防止被蛋白酶降解。
2) 將組織置于圓底的微量離心管中，并浸入液氮中進行“速凍”。將樣品保存在 -80℃下以便后續使用或放置在冰上進行直接勻漿。
3) 對于約 5 mg 的一片組織，需要向管中添加約 300 μl 完全提取緩沖液（查看細胞/組織提取緩沖液配方），然后用電動勻漿器勻漿。
4) 清洗刀片兩次，每次清洗使用 300μl 完全提取緩沖液，然后在 4℃下維持恒定攪拌 2 小時（例如置于冷室中的回旋振蕩器上）。
5) 在 4℃下以 13000 x rpm 離心 20 分鐘。置于冰上，將上清液（這里是指可溶的蛋白質提取物）等分至新的冷卻管中并在 -80℃下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。
注意：裂解緩沖液的體積必須根據存在的組織數量確定。最終蛋白質提取物的典型濃度 > 1 mg/ml。