在作為載體時，這些噬菌體有一個很大的優點，即克隆到M13mp載體的外源DNA片段（雙鏈），在子代噬菌體便成為了單鏈形式。故應用M13mp進行克隆，可方便地分離到大量含有外源DNA某一單鏈的DNA分子。這種單鏈DNA可在下列工作中作模板：①主要用作雙脫氧鏈終止法進行DNA序列測定的模板；②制備僅有一條鏈得到放射性標記的雜交用DNA探針；③利用寡核苷酸進行定點誘變。
M13mp18/M13mp19
三、真核細胞的克隆載體
無論是原核還是真核系統的基因克隆載體，作為載體都應具備三個相似的基本條件，即具備在宿主中進行復制的復制信號、適當的單一酶切位點和方便的選擇標記。在原核載體的基礎上進行適當的改造，可構建出帶有真核細胞復制信號的穿梭載體，使之能在真核系統中擴增。若加上適當的真核啟動子等元件，則成為真核表達載體，能在真核細胞中表達插入載體中的外源基因。為了鑒定和獲得陽性轉染細胞株，真核系統載體還必需具備適當的篩選標記。一種篩選標記是，使用遺傳缺陷型細胞株與載體的基因產物互補（如TK基因產物）。另一種普遍使用的是抗新霉素基因。真核系統載體種類很多，各具特色和用途，并且正在不斷被改進、完善，我們僅舉例簡要介紹。
㈠ SV40（猿猴病毒）載體
SV40基因組為約5.2kb的雙鏈DNA分子，堿基順序已完全清楚，且對其生活習性和各基因的調控也有較深的了解。同其他哺乳動物的DNA病毒一樣，SV40能在細胞中形成較高的拷貝數并具有強大功能的啟動子。因此，當今許多真核表達載體中的調控元件大都取材于SV40的調控順序和復制信號。一般以取代方式構建SV40重組子，天然SV40中能插入2.5kb的外源DNA片段。用SV40作為載體有兩種方式：①用SV40
DNA與外源DNA構建重組子，轉染細胞后允許細胞形成含外源DNA的病毒顆粒；②重組子不包裝成病毒顆粒，而象質粒一樣在細胞中復制或整合到染色體組中。
由于天然SV40病毒作為載體有諸多缺陷，實際上已很少使用。常通過使用SV40中的轉錄元件構建成穿梭載體克服其局限性。所謂穿梭載體是一類既能在原核細胞中復制又能在真核細胞中表達復制的載體。PSVK3是一類廣泛適用于哺乳動物細胞系表達外源基因的穿梭載體，全長3.9kb，由來自噬菌體、質粒和SV40病毒的DNA元件構建而成（圖7-6）。PSVK3具有下列構件：
1．原核系統構件：①復制子（質粒復制起始位點和絲狀噬菌體復制起始位點fl）；②篩選標志（Ampr）；③啟動子（T7啟動子）。
2．真核系統構件：①復制起始信號（SV40）；②啟動子（SV40早期啟動子）。
3．RNA修飾信號：①SV40小T抗原拼接信號；②SV40早期區mRNA polyA加尾信號。
4．多克隆位點 在SV40啟動子下游存在8個酶切位點。
pSVK3質粒
㈡ 反轉錄病毒載體
反轉錄病毒為單鏈RNA病毒，長約8～10kb，有類似真核mRNA的5′-甲基化帽和3′-polyA尾的結構。所有反轉錄病毒一般由核心蛋白基因、反轉錄酶基因和外殼糖蛋白基因三個共同的基因組成。許多反轉錄病毒尚有編碼轉化蛋白的癌基因，可轉化細胞。另外，在反轉錄病毒基因組的兩端還分別有一個長的末端重復序列（long
terminal repeat, LRT）,LRT中含有一個很強的啟動子。
反轉錄病毒載體（retrovial
vector）具有幾個特點：①這類病毒具有廣泛的哺乳動物細胞宿主；②病毒基因組有較大的容量，能插入7kb大小甚至更大的外源基因；③病毒基因組自身含有完整高效的調控元件；④病毒可通過主動感染方式進入宿主細胞，并能有效地整合到宿主染色體基因組中，與染色體一起復制、長期存在。⑤反轉錄病毒作為載體需要相應的外包裝，以形成完整的體系。
反轉錄病毒既可以構建成表達載體，即以完整的天然病毒雙鏈為基礎，外源DNA片段取代病毒中的癌基因,亦稱為御甲載體（disarmed
vector）；也可以構建成穿梭載體（shuttle
vector），由反轉錄病毒LRT、包裝信號等元件及質粒的原核復制、篩選元件重組而成。這類載體已成為動物細胞內表達外源基因的有力工具，并且正在臨床基因治療探索中發揮著重要的作用，當然其安全性有待進一步探索。
反轉錄病毒載體是一種向真核細胞轉移基因的有力工具，但亦有其局限性：①反轉錄病毒載體進入細胞依賴于細胞表面的受體，并且只能感染并整合到分裂增殖期的細胞，因此限制了其應用范圍；②其裝載容量較小，僅8kb左右，不適用于較大的基因；③其安性問題，最大的危險是制劑過程中可能存在具有復制能力的野生型病毒，可能造成細胞或機體的感染和破壞。因此反轉錄病毒載體的構建、改造及包裝細胞的選用，原則上都應避免產生有復制能力的野生型病毒。
四、人工染色體
常用的λ噬菌體載體能裝載的插入片段長約24kb，粘粒載體能接受的插入片段約35~45kb。由于許多基因過于龐大而不能作為單一片段克隆于這些載體之中，以及建立真核生物染色體物理圖及克隆其大節段的需要，二十世紀八十年代提出了建立人工染色體（artificial
chromosome）的概念和方法。在1983年成功地構建了第一條酵母人工染色體（yeast artificial
chromosome,YAC）以來，人工染色體的研究和應用不斷發展并取得了令人鼓舞的成就。繼YAC后，細菌人工染色體（BAC）、噬菌體P1衍生的人工染色體（PAC）和哺乳動物人工染色體（MAC）相繼問世。這里僅介紹YAC系統。
YAC是主要由著絲粒、端粒（telomere）、復制子和外源DNA構成的線狀DNA分子，具有天然酵母染色體的許多特征和生物性狀。YAC主要包括以下調控元件：①著絲粒，以保證染色體在細胞分裂過程中正確地分配到子代細胞；②端粒，作為染色體復制所必需的元件，具防止染色體被核酸外切酶降解的功能；③復制起始點和限制性酶切位點；④篩選標記，YAC載體的兩臂均帶有選擇標記，在酵母中選擇標記一般為色氨酸、亮氨酸、組氨酸或尿嘧啶的合成基因產物插入失活而進行篩選；⑤原核序列及調控元件，包括大腸桿菌復制起始點、Ampr基因等，以便于在大腸桿菌中操作。
YAC作為載體的主要特點是：①酵母是單細胞真核生物，可以似大腸桿菌一樣方便進行培養；②酵母的真核細胞轉錄系統，有利于表達真核生物的基因；③裝載容量巨大，可達百萬個堿基對（Mbp）水平，比常用的λ噬菌體載體和粘粒載體至少大十倍。
YAC的克隆程序相似于基因組DNA的常規克隆，DNA在片段連接到YAC載體的（兩）臂上形成重組體，隨后該重組體可通過常規方法導入酵母。在酵母中能準確地進行有絲分裂和減數分裂，而且還能生成蛋白產物。另外，還可以構建酵母穿梭質粒，是將酵母染色體中與復制子、染色體穩定性及表達相關的元件，同質粒（如pBR322）組建在一起。這種酵母穿梭質粒帶有質粒的復制起始位點和抗藥基因（如Ampr和Tetr），能在大腸桿菌中復制，并在真核細胞中表達。
目前，人工染色體尤其是YAC作為大分子外源DNA的克隆載體而廣泛應用于各種生物基因組計劃。已成為繪制基因圖譜、研究基因結構與功能、遺傳病基因鑒定和產生轉基因動物的重要工具。由于其裝載容量大，利用YAC構建人類基因組文庫，只需數千個重組體即可滿足需要。例如，應用YAC技術構建了覆蓋人類整個基因組的大片段DNA的YAC克隆片段重疊群，在此基礎上再進行人基因組計劃的大規模測序。