與在掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope, STM）中一樣，使用合適的探針（電極），可以得到納安級（nano-ampere）的電子隧穿電流。使用這種納安級的電流檢測堿基的速度比在直徑不到 3nm的納米孔中使用皮安級的電流檢測要快得多。雖然這種方法只需使用納米孔和電流檢測設備，并有望成為最便宜、最快速的測序技術，但它也面臨著四種主要的挑戰（表13）。
不過，現在使用單壁碳納米管（single-walled carbon nanotube）就有望解決上述第二和第三個挑戰，如果對碳納米管進行合適的改造甚至還能解決第一個挑戰。納米管能以一種獨特的方式和方向與堿基結合， 而且每一個堿基的結合活化焓（binding activation enthalpie）為了便于控制DNA鏈通過納米管的速度，也都處于可被溫度、離子強度或偏置電壓調控的范圍之內。
要借助橫向隧穿電流來分辨堿基還有一種方法，就是在化學修飾的金屬電極和待測堿基之間形成堿基特異性的氫鍵。Ohshiro和Umezawa發現， 在STM中如果金屬探針（電極）被A、G、C、U的硫氫基（thiol）修飾之后，電極和堿基之間的隧穿電流會被極大地放大。他們發現，使用經胞嘧啶修飾 過的探針（電極），可以區分出序列TTTTTTTTGTTTTTTTTT和序列TTTTTTTGGTTTTTTTTT。基于Ohshiro和 Umezawa的工作，Lindsay等人猜想，是否可以使用經兩種不同化學修飾方法加工過的電極，令其中一組電極能結合核苷酸的磷酸基團，而另一對電極能結合核苷酸的堿基基團（圖11）。這樣，在每一個核苷酸通過納米孔中的“閱讀器（電極）”時就會通過“電流距離”（current-distance） 而不是通過靜態的“隧穿電流”而被檢測出來。A、C、G、T四種“閱讀器”中的每一種都會借助上面的功能基團與通過納米孔的同一種堿基形成氫鍵。將這四種 閱讀器鏈接在一起形成“DNA鏈”就可以對dsDNA鏈進行測序了。不過，要同時將四條dsDNA鏈穿過四個閱讀器還是一大難題。
還有人提出可以將金屬氧化硅電容和納米孔技術結合在一起通過對DNA進行靜電檢測以達到測序的目的。透射電鏡（transmission electron microscope, TEM）發射的電子束可以將納米孔固定到兩層摻雜硅構成的膜上（中間被厚約5nm的SiO2絕緣層隔開）。當有DNA鏈穿過納米孔時，可以檢測到兩層硅膜間電容的靜電勢和電壓發生了改變。仿真結果表明，A、C、G、T都有其各自獨特的電容信號，因此從理論上來說也可以通過這種方法進行測序。在早期的一次試驗中發現能夠檢測到DNA鏈通過納米孔時引起的電壓變化，但是由于時間太短，還無法區分出單個的堿基。目前，該方法面臨的主要問題也是如何控制堿基通過納米孔時的速度和方向。
3. 獲取較長的測序長度
納米孔測序技術還有一個非常吸引人的優勢，那就是測序距離長。因為納米孔測序儀對通過的每個堿基進行測序，與前后的測序結果都無關。因此從原則上來說，使用納米孔測序技術，只要DNA鏈不發生斷裂，并且能一直通過納米孔，就可以一直檢測下去。到目前為止，人們已經證明，長達25kb的ssDNA能夠一次性通過生物納米孔，長達5.4kb的ssDNA能夠一次性通過固態納米孔。因此，如果檢測技術能得到進一步的改善（能檢測快速通過納米孔的堿基），納米孔測序技術還是具有非常好的應用前景的。雖然現在還無法確切獲悉納米孔測序技術的準確度有多高，但可以確定插入、缺失等序列錯誤不會影響片段的讀出長度，因為相移在獨立的單分子讀序中并不是一個問題。只要所測序列是隨機的，而不是系統的或具有位點依賴性的，那么足夠高的序列覆蓋率便可以保證任何水平的準確度。
此外，雖然目前的第二代測序儀的測序長度較短，但它們具有高通量的優勢，因此可以將納米孔測序技術和這些第二代測序技術結合起來，以彌補第二代測序儀在測序長度方面的不足。
考慮到在未來的測序技術發展趨勢中，測序長度是至關重要的一個指標，因此還需要進一步研究，以弄清納米孔測序技術在檢測ssDNA時測序的極限長度 是多少。納米孔測序技術在檢測單鏈寡聚物（不到50個堿基）時可以進行高通量檢測，此時核酸鏈通過α溶血素納米孔的速度大約是5.8個低聚物/sec μM。因為核酸鏈大分子穿過納米孔的速度與其在溶液中的摩爾濃度有關，而摩爾濃度又不能太高以免溶液太粘稠，因此還需要進行試驗驗證50kb長的ssDNA是否能以一個合適的速度通過納米孔。已經有幾篇論文報道指出，使用直徑約3nm~6nm的納米孔能夠檢測長約3kb~10kb的ssDNA及 dsDNA片段（核酸分子的濃度在10nM~20nM之間），不過文章中都沒有提及核酸分子通過納米孔的速度。此外，雖然Branton等人已經證實了48kb的λ-DNA可以通過納米孔，但是使用最新的納米孔捕獲及再捕獲技術對長基因片段進行測序時的效率更高。納米孔捕獲及再捕獲技術對于提高測序質量 非常重要，因為借助這種技術就可以對同一個堿基進行反復測序。當堿基初次通過納米孔時，如果檢測信號質量不高，實時監測軟件就會“命令”該堿基再次通過納 米孔并重新接受檢測，直至獲得滿意的信號為止，而不需要重新準備樣品，從頭再測一次。
4. 控制DNA通過納米孔
DNA高速通過納米孔的特性使得高速測序成為可能，但同時這種高速度也正是很多納米孔測序技術的“阿喀琉斯之踵（‘Achilles’ heel，意即弱點）”。因為速度太快，檢測的信號質量就不高，甚至很多小的信號根本就檢測不到。在120mV的條件下，DNA會以每個堿基 /1μs~20μs的速度通過α溶血素納米孔。這就需要探測器的檢測帶寬達到MHz級，才能檢測到皮安級的電流強度。
當DNA在電泳作用下通過納米孔時，由于擴散作用的影響，降低了測序的質量。由于DNA分子的隨機運動使得它通過納米孔的時間，即通過時間 （transit time）的跨度非常大（這一點從理論上和試驗上都已經證實了），因此，人們無法判斷有多少堿基通過了納米孔。而且，由于跨孔DNA分子與納米孔表面間存在的非特異性的相互作用還會受到非連續性的粘滑現象（discontinuous stick-slip phenomena）影響，所以相互作用會發生改變。這種相互作用改變的本質和頻率會引起“逃避時間（escape time，解離時間）”發生非泊松分布（non-Poisson distribution），于是，同一種堿基分子通過納米孔時的通過時間也會不同。而且，如果堿基分子通過納米孔的時間小于平均通過時間，那么它極有可能被漏檢。
鑒于此，對于納米孔測序技術來說，最為重要的一點就是如何控制并減慢DNA分子通過納米孔的速度，同時盡量消除由于納米孔表面相互作用給DNA分子 跨孔動力學上造成的波動現象。降溫和增加溶液的粘稠度可以在一定程度上減慢DNA分子通過納米孔的速度，但這兩種方法都不能消除因納米孔表面相互作用造成 的跨孔動力學波動現象。真正能降低DNA跨孔速度的方法見表14。
上述這些限速步驟所達到的速度都在每個堿基/數毫秒級，同時還都會受到離子強度、溫度以及跨孔偏置電壓的影響。
最理想的狀態是，如果能發現一種電信號來代表堿基間的“空隙”，那就能清楚地知道有多少個堿基通過了納米孔了。這種信號對于分析跨孔動力學和堿基孔
內停留時間等都具有很高的使用價值，而且可以據此來決定測序儀的檢測帶寬和其它參數。但在該信號出現之前，人們還需弄清楚DNA的跨孔動力學，同時還要開
發出控制DNA跨孔速度的辦法。納米孔制造技術的發展使得我們能夠制造出特殊的納米孔，這些納米孔的背景噪聲很低，而且能夠調控DNA與納米孔表面的相互
作用。最終，將DNA跨孔速度控制技術、高帶寬技術、低噪聲檢測技術結合在一起，就能制造出高速納米孔測序儀了。
5. 生物納米孔的穩定性問題和固態納米孔的制造問題
溶血素七聚體（hemolysin heptamer）是最常用于在脂質雙分子層中制造生物納米孔的材料，它性質非常穩定。但脂質雙分子層的性質卻不那么穩定，尤其是液態脂質雙分子層，制造起來極難且費時。
Bayley等人發現包裹在兩層薄瓊脂糖中的裝載有α溶血素納米孔的雙分子層非常穩定，可以被裝到特氟隆薄膜（Teflon film）中儲存數周之久。同時他們還發現，α溶血素納米孔可以被頂端是瓊脂糖的塑料或玻璃探針裝載到上述雙分子層組成的芯片上。另一種穩定雙分子層的方 法是使用納米級的孔徑而不是微米級的孔徑。試驗證明，在玻璃毛細管末端的直徑為100nm~1,000nm的雙分子層在包被有特殊硅烷化劑 （silanizing agent）的條件下能保持穩定達兩周以上。
使用離子束雕刻（ion beam sculpting）、電子束鉆孔（e-beam drilling）和原子層沉積（atomic layer deposition）等方法可以在氮化硅、氧化硅或其它金屬氧化物等介質上“制作出”穩定的、有功能的固態納米孔，不過要得到直徑在 1.5nm~2.0nm的納米孔芯片還是一件非常困難的工作。現在，人們已經可以制作出裝載有用于檢測隧穿電流探針的納米孔，但是目前的納米孔制作工藝非 常繁瑣，速度慢又耗費人力，而且制作出的產品還常常無法達到應用的要求。毫無疑問，隨著納米電子學領域的不斷發展，人們一定會制造出高質量的納米孔芯片。但是，直到納米孔測序技術被證明是可行的那一天為止，納米孔測序研究領域的科學家都會一直面臨一個問題，那就是只能使用科研設備，而不可能使用大量生產的商業化設備。
對于某些納米孔測序技術來說，最穩定的納米孔可能是固態納米孔和α溶血素納米孔的“雜交體”，即在氮化硅之類的人工膜上做出5nm左右的納米孔，同時也裝載上α溶血素納米孔。如果這種方法可行，那么該雜交納米孔就既有高度的重復性又有無限的穩定性。
6. 結論
如果納米孔測序技術能夠成功，那么它將是非常好的一種新的測序技術，因為它具有以下優點（表15）。
因此，一個成功的納米孔測序儀其測序費用應該非常低廉，極有可能達到NIH設定的只用1,000美元就能完成個人基因組測序的目標。同時，納米孔測序儀本身不會太貴。如果能在一個測序芯片上整合100個納米孔以及相應的微流體系統和電子探針系統，那么對一個人類基因組進行六倍覆蓋率的測序也只需要一天的時間。不過，納米孔測序技術還是面臨著很大的問題。短期內的一個主要問題就是如何減慢DNA通過納米孔的速度，使每一個堿基通過納米孔的時間從微秒級上升至毫秒級。
最近，有研究結果表明DNA酶處理能起到減緩的作用。如果納米孔測序儀用到了溶血素七聚體，那么就還需要與之相配套的穩定載體。目前，這方面的工作 也取得了一定的進展。不過從長遠來說，人工合成的固態納米孔似乎更適合商用。人們可以通過監測隧穿電流或電容的改變來“讀取”每一個通過納米孔的堿基，不 過這種方法是否切實可行還需要進一步驗證。還有一個一直存在的問題是：不論用哪種檢測方法，DNA分子在通過納米孔時發生的隨機運動都會增加背景噪聲。
綜上所述，納米孔測序技術具有非常誘人的應用前景，因此我們還得繼續努力研究下去。而且隨著研究的深入，我們越來越堅信，納米孔測序技術一定會成功的。
原文檢索：Daniel Branton, David W Deamer, Andre Marziali et al. (2009) The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology26(10): 1146-1153.