DNA復制叉穩定機制研究

　　解開50年謎題

　　“DNA復制錯誤主要來自DNA復制叉的不穩定。”孔道春對《中國科學報》說，“揭示checkpoint調控維持停頓復制叉穩定的核心分子機制，找到DNA復制叉不穩定的原因，人們就可以有的放矢，在疾病篩查、靶向藥物開發方面做很多工作。甚至可以在增強DNA穩定性方面有所作為，如果能讓DNA復制叉更穩定，就有可能延長人類（包括其他生命體）的壽命。”

　　孔道春解釋說，DNA復制叉主要由兩部分構成，Y字型的DNA結構和DNA復制體。DNA復制體包含一系列與復制相關的蛋白質及蛋白質復合物，其中，最重要的是打開雙鏈DNA模板的CMG解旋酶復合物，以及進行新生鏈DNA合成的DNA聚合酶。

　　“生命科學領域有很多待解謎題，而細胞周期檢驗點調控維持停頓復制叉穩定機制，是該領域的核心謎題之一。”孔道春說，“正常移動的DNA復制叉是相對穩定的，DNA復制體中的CMG解旋酶與DNA聚合酶在物理及生化功能上緊密偶聯。當DNA復制叉遭遇復制障礙停頓下來時，停頓的DNA復制叉被證明是不穩定的，傾向于垮塌。”

　　拉開機制研究帷幕

　　上個世紀60年代末，科學家在裂殖酵母里篩選到了一株突變株，命名為rad3-136。很快，研究人員發現，rad3-136突變株對羥基脲 (HU抑制dNTPs合成，導致DNA復制叉停頓）高度敏感。至此，真核細胞維持停頓DNA復制叉穩定的機制研究拉開了序幕。

　　1988年，Rad3及相關蛋白介導的細胞調控被科學家命名為checkpoint調控,Rad3被歸類為ATR激酶。

　　過去50年，前后上千個實驗室，用兩代人的時間，發表了上萬篇研究文章，證明checkpoint是維持停頓DNA復制叉穩定的必需細胞調控。在checkpoint缺失或缺陷的細胞，停頓的DNA復制叉發生垮塌，導致DNA復制不能完成，及基因組的極度不穩定。

　　但在試圖闡明checkpoint調控維持DNA復制叉穩定的機制研究方面，科學家碰到了極大阻力。阻力主要來自于checkpoint調控的靶蛋白極難被確定，已發表文章的結論也互相矛盾，導致checkpoint調控維持DNA復制叉穩定的核心機制長期難以確定。

　　闡明核心機制

　　通過大規模的遺傳篩選，孔道春實驗室發現，復制解旋酶CMG復合體的一個亞基Cdc45的突變，能極大降低(600~3000倍)checkpoint通路缺陷細胞對HU的敏感性。

　　“這暗示Cdc45或CMG復合體可能被checkpoint調控。”孔道春說，“通過一系列遺傳及生化分析，我們發現DNA復制叉停頓后，Cds1Chk2同時磷酸化Cdc45亞基上的三個絲氨酸殘基。這三個絲氨酸殘基的磷酸化導致CMG復制解旋酶活性深度降低。CMG復制解旋酶活性的降低使得它不能脫離停頓復制叉，不能與被阻擋的DNA聚合酶分開。這樣，停頓的DNA復制體及復制叉的生化完整性得到了維持，從而阻止了停頓DNA復制叉的垮塌。”

　　穩定停頓復制叉機制示意圖。

　　 “停頓DNA復制叉里的復制解旋酶與DNA聚合酶傾向于分開關聯到兩件事情，一是DNA復制體或DNA復制叉的基本生化特性；二是正常細胞生長過程中導致復制叉停頓的基本原因。” 該論文共同第一作者劉陽告訴《中國科學報》，“DNA二級結構導致的復制叉停頓是一個經常發生的生物事件。在前導鏈或后隨鏈的DNA模板上，如果有堿基損傷（每個人細胞每天有約105級別的這類損傷）或化學修飾，也會阻擋DNA聚合酶并導致復制叉停頓。當DNA聚合酶被阻擋后，CMG解旋酶還要往前移動，這樣就會導致CMG解旋酶與DNA聚合酶物理上的分開，導致復制叉垮塌。”

　　真核細胞 DNA 復制叉及 S 期細胞周期檢驗點。

　　經過不懈努力，checkpoint調控維持停頓DNA復制叉穩定的核心機制最終得以闡明。即,停頓復制叉不穩定、傾向于垮塌的根本原因是當DNA聚合酶被阻擋后，復制解旋酶與DNA聚合酶傾向于分開。同時checkpoint調控維持停頓復制叉穩定的核心機制是:降低復制解旋酶的活性，阻止復制解旋酶脫離復制叉或DNA聚合酶，維持兩者之間在物理及生化功能上的緊密偶聯，從而維持停頓復制叉穩定，并保持它的生物學功能。

　　“找到問題，找出問題的原因，往往離解決問題就不遠了，希望這些研究能讓人們離戰勝癌癥等重大疾病更近一些。”孔道春說。