1)取一個較大的方形瓷盤,放一塊玻璃板于盤上,盤內加轉移液(6×SSC或10×SSC)使液面距離玻璃底面約1,2cm,玻璃板表面蓋兩張預先用轉移液浸潤的Whatman 3M ·濾紙(也可用新華濾紙),濾紙兩端浸入SSC轉移液中,用一玻璃棒將濾紙壓平,濾紙與玻璃板間不得有氣泡,
2)將瓊脂糖凝膠翻轉(樣品孔朝下)后置于上述鋪有Whatman 3M·濾紙的平臺上,注意:兩者之間不能有氣泡。
3)用parafilm 蠟膜將凝膠四周平臺上裸露的濾紙封嚴,防止在轉移過程中因短路(轉移液直接從盤中流向吸水紙而不經過凝膠)使轉移效率降低,甚至轉移失敗 ,
4)將處理好的NCP(已切去一角)小心地覆蓋在凝膠上(濾膜的光澤面即標有N.C字樣的一面朝向凝膠),NCP的一端與凝膠的上樣孔對齊,切去的一角與凝膠切角的位置對齊。 注意,濾膜與凝膠之間不能有氣泡,且NCP一旦與凝膠接觸即不可再移動,因為從接觸的一刻起,DNA已開始轉移,
5)將預先用轉移液浸潤過的與NCP大小相同的Whatman 3M濾紙覆蓋在硝酸纖維素膜上,排出濾紙與膜之間的氣泡,
6)再放幾張相同大小的干濾紙和一疊厚約10,15cm的吸水紙于濾紙上,頂部壓一塊玻璃板和1kg左右的重物。
7)靜置12,15小時使其充分轉移,其間換吸水紙1,2次。轉移液在吸水紙的虹吸作用下從盤中轉移到吸水紙上,從而帶動DNA從瓊脂糖凝膠中轉移到NCP上,
8)轉移結束,移去吸水紙和濾紙,在NCP上用鉛筆標上點樣孔的位置。·將NCP浸泡在2×SSC中5分鐘以去除瓊脂糖碎塊。將膜放置于一張干燥的新鮮濾紙上,
9)在紫外燈下觀察凝膠和NCP膜,以了解DNA轉移的情況。·在紫外燈下凝膠不顯示熒光,NCP膜呈桔紅色,并可見到條狀的DNA帶。
10)把NCP置于兩層干燥新鮮的濾紙間,真空下80℃烘烤2小時(亦可用其它方法)。此過程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。
11)此NCP既可直接用于雜交,亦可用塑料薄膜密封,置,20℃冰箱保存備用。