ChipQPCR定量分析方法分享

相關專題

Q-PCR定量分析CHIP

最近做了CHIP，用Q-PCR方法進行定量分析，現將我對一些文獻資料的總結傳上，希望對大家有幫助！

i. Normalizeeach ChIP DNA fractions’ Ct value to the Input DNA fraction Ct value
for the same qPCR Assay (ΔCt) to account forchromatin sample preparation
differences.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Where, Input Dilution Factor = (fraction of theinput chromatin saved)-1
Average normalized ChIP Ct values for replicate samples.
ii. Calculate the % Input for each ChIP fraction(linear conversion of the normalized
ChIP ΔCt).
% Input = 2 (-ΔCt [normalized ChIP])
iii. Adjust the normalized ChIP fraction Ct valuefor the normalized background
(NIS/mock IP) fraction Ct value (first ΔΔCt).
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt[normalized NIS/mock]
iv. Calculate Assay Site IP Fold Enrichment abovethe sample specific background
(linear conversion of the first ΔΔCt).
Fold Enrichment = 2 (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
v. Determine the difference between the normalizedexperimental sample (S2) and
the control sample (S1) ChIP fraction Ct values(second ΔΔCt).
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
vi. Calculate Differential Occupancy Fold Change(linear conversion of the second
ΔΔCt to yield a fold change in site occupancy).
Fold Change in Occupancy = 2 (-ΔΔCt [S2-S1])

ChIP完定量的計算方法：
1）雙△CT法；
2）雙標準曲線法。

Comparative Delta-delta Ct法的特點、注意事項及實際應用：

1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特點是，當優化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。
2. 每次實驗都默認目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優化，并且總會存一定的偏差。
用ComparativeDelta-delta Ct法展開定量實驗前，在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-Gene 的會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。
雙標準曲線法考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率。

雙標準曲線法的特點、注意事項及實際應用：

1. 雙標準曲線法做相對定量分析的最大特點是，應用簡便，無需像Delta-delta CT法那樣對實驗進行嚴格的優化。
2. 其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。
并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質粒或純化的PCR產物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標準曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。
每種相對定量方法都會有一定的局限性，對于雙標準曲線法，比較適合于樣本量不大，但研究的基因較多的客戶，這樣對不同基因條件優化相對Delta- delta Ct法更為簡單。

雙△CT法：
1. 標準化DNA的量 Normalize DNA.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Input Dilution Factor = (fraction of the inputchromatin saved) -1 (-1次方)
2. 計算百分比
% Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP])
對于后面的問題，還要有一些計算，
3. 要加入陰性對照的Ct值
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [陰性]
4. 計算Assay Site IP Fold Enrichment
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
5. S1和S2的比值計算
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
6. 樣品比值= 2 ^(-ΔΔCt [S2-S1])
請注意以上2之后為指數，fraction of the input chromatin saved指input在樣品總體中的比例，如你在1ml 總DNA中取10ul，那么這個比例就為1%, Input Dilution Factor=100

如所得的數據如下：實驗組（S2）和對照樣本（S1）
實驗組（S2）：其Ct值，Input為27.674; 目標蛋白30.239; 陰性對照31.983; Input稀釋倍數（從1000ul體積中取了80ul作為input），
對照樣本（S1）:其Ct值，Input為25.63; 目標蛋白31.935; 陰性對照33.14; Input稀釋倍數（從1000ul體積中取了80ul作為input）。

雙△CT法：
1. 標準化DNA的量 Normalize DNA.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Input Dilution Factor = (fraction of the inputchromatin saved) -1 (-1次方)
S1： ΔCt [normalized ChIP] = [30.239-(27.674 –log2 (12.5)) ] 
= 3.662
S2： ΔCt [normalized ChIP] = [31.935-(25.63 – log2(12.5)) ]
= 7.402

2. 計算百分比
% Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP])
S1: % Input = 2 ^(-3.662) = 0.079 = 7.9%
S2: % Input = 2 ^(-7.402) = 0.006 = 0.6%

3. 要加入陰性對照的Ct值
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [陰性]
S1: ΔΔCt [ChIP/NIS] = 3.662- 31.983 = -28.321
S2: ΔΔCt [ChIP/NIS] = 7.402- 33.14 = - 25.738

4. 計算Assay Site IP Fold Enrichment
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
S1: Fold Enrichment = 2^(28.321) = 335328531
S2: Fold Enrichment = 2^(25.738) = 55964165

5. S1和S2的比值計算
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
ΔΔCt [S2-S1] = 7.402- 3.662= 3.74

6. 樣品比值= 2 ^(-ΔΔCt [S2-S1])
樣品比值= 2 ^(-ΔΔCt[S2-S1]) = 2^3.74 = 13.36

計算出來的過程應該是這個樣子的，需要指出的是，由于論壇排版的問題，log2是以2為底的log，不是2×Ct，呵呵。

對于單個樣品來說：
第2步的作用是計算每個樣品的富集倍數，也就是抗體拉下來的DNA的量，和input相比，百分比是多少。
3-4步是指向對于陰性對照（IgG）來說，目標蛋白的抗體來下DNA是多少倍于IgG拉下來的背景值。

5-6步是計算兩個樣品之間的比值的。