Cell：科學家利用新方法鑒定腫瘤免疫治療新靶點

　　2017年5月，《Cell》雜志連續刊登了美國西奈山伊坎醫學院研究人員的工作，他們分離了來自肺癌病人腫瘤組織、正常肺組織以及外周血的免疫細胞，利用TCR測序和質譜流式（CyTOF）等技術對細胞特定轉錄本和表面30多個蛋白Marker進行檢測分析，繪制了早期肺腺癌腫瘤微環境中免疫細胞的詳細圖譜。根據測序比對和質譜流式的分析結果，發現早期的腫瘤就已經開始在改變其微環境中的免疫細胞組成和表型了，尤其是T細胞、天然殺傷細胞和腫瘤浸潤髓系細胞（TIM）。

　　數據結果

　　作者利用Phenogragh（一種以Unsupervised方式進行細胞分群的生物信息學分析工具），將T細胞（CD3+ cells）分為21個具有不同表面marker表達模式的亞群 ：

　　通過對這些亞群各個Marker的表達情況我們可以得知，其中有的亞群對應于我們已知的一些T細胞亞群，例如亞群I是CD4+ Th1 CM，亞群VI是Treg，但還有一些以前傳統手段未識別出來的新亞群（例如亞群IX、XX等）。

　　通過對比這些亞群在不同樣本中的比例，作者發現亞群VI（Treg）、亞群V（CD4+PD1+T）等多個亞群特異的出現在腫瘤組織中，提示這些亞群與腫瘤的發生過程有著密切的聯系。

　　作者接下來進一步研究了腫瘤組織中靶向分子PD-1與不同T細胞亞群間的關系。數據顯示PD-1僅在腫瘤組織CD4+和CD8+細胞中顯著表達；通過ImmunoSEQ方法對細胞樣本TCRbeta鏈的CDR3區域進行測序，分析發現雖然在腫瘤組織和正常肺組織中總體的TCR克隆型并無明顯差異，但是在腫瘤組織中TCR克隆的形成和擴增明顯和CD8+PD-1+ T細胞亞群特異性相關，且多發于TLS富集的腫瘤病灶區域，該現象在正常肺組織中并未觀察到。

　　同樣，作者用類似的方法分析了CD3 -細胞，將B細胞和髓系細胞精細的分為了20個亞群，通過對比這些亞群出現在不同組織的比例，作者發現了在腫瘤組織和正常肺組織內免疫細胞亞群構成和功能的巨大差異。例如，DC細胞（也成樹突狀細胞）在誘導腫瘤免疫的過程中發揮了重要的抗原遞呈作用。在這項研究里，這類細胞被分為兩個表型不同的亞群：CD141+DC和CD1c+DC，轉錄組數據表明兩群細胞具有不同的活性，相比之下，除了細胞表面的一些重要的免疫功能相關受體有表達有差別外，前者的溶酶體相關基因具有更高表達水平。經過統計，作者發現CD141+DC在腫瘤組織中的比例顯著低于正常肺組織，而CD1c+DC則差異不大。

　　與T細胞的結果類似，DC細胞亞群和功能的變化也反映了腫瘤組織中免疫細胞功能的失調。后續的分析表明，類似的變化還出現在NK細胞、單核細胞（Monocyte）、巨噬細胞（Macrophage）等細胞類型。這些信息匯總起來，充分說明肺癌腫瘤免疫微環境的系統性改變。以往的研究，一般專注于T細胞功能的改變，這項研究是對已有腫瘤免疫理論的重要補充和細化。相應的，在腫瘤的免疫治療領域，主要也還是以激活T細胞為主（例如CAR-T，各種免疫檢查點類的抗體藥物），如果能采取措施活化腫瘤組織浸潤的髓系細胞加以配合，很有可能大幅提高免疫治療的效果。

　　研究意義

　　盡管該研究尚未直接改變目前的癌癥治療方案，但來自Dana-Farber Cancer Institute的免疫學家W. Nicholas Haining教授指出，該研究的重要性絕不局限于具體的實驗結果，而在于所拓展的研究方向——腫瘤微環境中免疫細胞組成對患者預后的指示性作用及對癌癥治療的指導意義。

　　“我們需要對數百名癌癥患者、數十種腫瘤類型進行研究，達到對每個樣本要能分析數千個免疫細胞的水平，”他說道：“這是我們為了解這背后的生物學機制所必須做的。”

　　如何對細胞亞群進行精確細分？

　　已有報道數據顯示，目前僅以一到兩種蛋白質的表達來推斷T細胞或巨噬細胞狀態的做法，很可能會遺漏掉重要的信息(ref2)。傳統方法多用流式細胞分析技術對細胞進行亞群分析，然而由于方法學上的限制，目前在單一樣本上很難進行數十種參數的同時檢測。

腫瘤相關巨噬細胞（上）和T細胞（下）分型的蛋白標記物(ref2)

　　Fluidigm公司的質譜流式ZL技術，利用金屬元素標簽進行抗體標記，大量去除背景噪音對實驗結果的影響，并有效避免了傳統方法下檢測信號間的交叉重疊，無需熒光補償。利用Helios質譜流式細胞儀可對樣本同時進行超過40 種參數的高效檢測，不僅可用于常規樣本檢測，更可解決某些臨床珍貴樣本量少的問題；同時通過單樣本多參數檢測，可對數據結果進行全面綜合分析，避免了“盲人摸象”現象的產生。

　　另一方面，在T細胞研究中，TCRa、b鏈上的可變區域序列信息是分析T細胞克隆亞型的關鍵信息之一，其多變性和復雜性往往對T細胞分群和功能研究造成很大影響。區別于文章中所用的ImmunoSEQ方法僅針對群體細胞樣本TCR的3’-end和CDR區域進行檢測，Fluidigm公司與Sanger和EMBL-EBI等機構在單細胞水平合作開發了新的TCR序列分析方法——TraCeR(ref3)， 該方法通過C1系統制備單細胞全轉錄組后進行測序分析，數據不僅可以提供TCR全部可變區域序列信息，更可進行TCR全長序列分析，基于該分析結果能夠準確、細致鑒別各種環境下的T細胞克隆亞型，對樣本中復雜的T細胞群的表型和功能進行精確分析。該系統實現了從細胞捕獲到核酸制備全部過程的自動化，可快速制備單細胞全轉錄組、全基因組及靶向序列的核酸樣本。