CellRes:中國學者用韓春雨基因編輯新技術研究斑馬魚

　　2016年，生命科學界的一個熱門人物，當屬河北科技大學生物科學與工程學院生命科學系副教授韓春雨。在今年的5月份，他作為通訊作者在國際學術期刊《Nature Biotechnology》提出一種新的基因編輯技術——NgAgo-gDNA，向當前最火熱的“第三代”基因編輯技術CRISPR-Cas9發起了挑戰。（韓春雨：“冷板凳”上坐出科學新秀）

　　韓春雨及其團隊的發現被一些人稱作是“第四代”基因編輯技術。然而，之后的故事急轉直下，全球數百家實驗室，歷時5個月的時間，沒有一家宣布能重復成功（韓春雨基因編輯技術在數百個基因中均重復失敗）。質疑聲越來越大，韓春雨不作正面回應，卻收獲接連的榮譽：河北科協副主席、美麗河北最美教師、100萬元國家自然科學基金……受惠于NgAgo技術，河北科大獲得了河北發改委2.24億元的財政撥款，用于建設河北科技大學基因編輯技術研究中心。

　　剛剛過去的10月份，有13位生物學家一致表示，希望韓春雨能公開所有原始數據，韓春雨所在河北科技大學及其他相關單位（如：國家自然科學基金委員會）啟動學術調查（13位科學家實名呼吁對韓春雨啟動調查）。也有科學家對此提出了不同意見（高福院士談如何看待韓春雨事件：是否有真正的科學發現才是關鍵）。一時間，韓春雨以及他的NgAgo基因編輯技術，陷入了風口浪尖之中。

　　11月11日，當大家還沉浸在雙十一購物狂歡的時候，《Cell Research》雜志以Letter to Editor形式在線發表了來自南通大學和復旦大學研究人員合作完成的一項研究，題為“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”，這項研究的結果表明，gDNA/NgAgo 系統在斑馬魚中能實現特定基因敲低，導致魚眼部發育缺陷，但是不能對靶基因進行基因編輯。

　　這篇論文的通訊作者是南通大學江蘇省神經再生重點實驗室的劉東副教授，根據該實驗室官網資料顯示，劉東于2011年從德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心/柏林自由大學獲得自然科學博士學位，從2012年8月起任南通大學神經再生重點實驗室副教授，2013年起擔任碩士研究生導師。論文的另一位合作者，是來自復旦大學生命科學學院的王永明研究員，他曾于2015年入選中組部青年千人計劃，主要研究方向是建立高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術用于通過建立疾病模型和篩選相關治療藥物等。

　　脂肪酸結合蛋白11a（Fabp11a）是細胞內的FABPs家族中的一個成員，它對于調節糖和脂質代謝平衡以炎癥，扮演著重要的角色。到目前為止，Fabp11a在斑馬魚胚胎發育中的作用還不清楚。為了探討5′-磷酸化的單鏈（ss）DNA是否可以指導NgAgo在體內破壞斑馬魚的內源基因，該研究小組為斑馬魚構建了一個密碼子優化的NgAgo，在N-末端和C-末端具有核定位信號（NLS）肽（NgAgo-2nls）。

　　研究人員針對Fabp11a合成了兩個24bp的5’-磷酸化ssDNA寡核苷酸，并把每一個與NgAgo-2nls mRNA共同注射到1細胞期的胚胎中。有趣的是，他們觀察到，大約30%的注射胚胎表現出重度眼部表型，要么是一只非常小的眼睛和一只相對正常大小的眼睛（1型），要么是在頭頂有一只大的融合眼，就像獨角龍一樣（2型）。

　　為了探討眼表型是否是由fabp11a基因突變引起的，研究人員提取了具有異常眼部表型的胚胎的基因組DNA，并對靶區域進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增。測序結果表明，靶基因沒有發生任何基因突變，但是通過RT-PCR檢測發現，Fabp11a基因的表達驚奇的發現該基因的表達有顯著下調。

　　為了更清楚的說明問題，作者進一步做了一些實驗，排除了單獨由NgAgo-2nlsmRNA或者gDNA注射到胚胎所導致的表型，而且同時注射NgAgo-2nlsmRNA和錯配的gDNA也不會產生表型，這些實驗結果表明，gDNA/NgAgo系統有其特異性。另外的實驗結果表明，gDNA/NgAgo系統靶向敲低Fabp11a基因所導致的斑馬魚眼部異常表型，可以通過注射Fabp11amRNA修復。為了進一步確認gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現象，作者又檢測了另外一個基因ta（no tail/ntl or brachyury），結果表明也有大約30%注射過的胚胎表現出沒有尾巴的表型。

　　此前，韓春雨在《Nature Biotechnology》的文章中表明，gDNA/NgAgo系統在人源細胞（37℃）中能夠有效地產生11.2%至41.3% 的插入。在《Cell Research》這篇文章中，研究人員也在37℃的條件下檢測了斑馬魚中gDNA/NgAgo系統是否能產生插入，結果表明沒有檢測到任何插入發生。有趣的是，在正常情況下，斑馬魚胚胎中注射gDNA和酶活突變的NgAgo mRNA也能產生系列表型，當然同樣檢測不到任何插入的發生。為了再進一步確認斑馬魚的表型是由于Fabp11a敲低造成的，作者還做了一些后續的原位雜交實驗，而且還運用CRISPR/Cas9技術敲除Fabp11a基因，也能得到相似的表型，當然基因敲除的表型顯然異常劇烈一些，有大約10%的胚胎表現出了眼睛消失的表型。

　　總而言之，這項研究結果通過使用gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中實現了特定基因的敲低，但是，并沒有檢測到靶基因上出現任何的插入，因為酶活突變的NgAgo也能產生敲低的效果，作者猜測，該系統可能和酶活突變的Cas9：sgRNA系統類似，都能在靶基因處抑制基因轉錄。作者最后指出，gDNA/NgAgo系統能夠為斑馬魚基因敲除提供一種替代策略。