說到基因編輯，大家都會想起CRISPR技術。這個當年名聲大噪的技術，現今依舊熱度不減，尤其是我們的CRISPR大神張鋒，近期發表的文章頻頻亮相于知名雜志，又引起一片熱議。時過境遷，CRISPR技術并沒有銷聲匿跡，一直在線。但任何事物包括技術有利就有弊，CRISPR技術當然也毫不例外。
CRISPR技術就是這么好用！
火了四年之久的技術，耳熟能詳的優勢顯而易見：摒棄了對于ES細胞的依賴，CRISPR技術實現了對大鼠、豬、猴、斑馬魚等多種物種的編輯；CRISPR技術依賴于Cas9和sgRNA實現“精準”切割，簡化實驗步驟，大大縮短實驗周期。周期短、工作量小，隨之而來的就是費用的降低。綜上，性價比高的技術當然當仁不讓的會一直火。
CRISPR技術也有缺點？
CRISPR技術自問世以來，被應用至世界各地眾多實驗室中進行科學研究，在享受其優勢的同時，它的弊端也是眾所周知：sgRNA與Cas9蛋白這哥倆，并不是時時刻刻都兢兢業業工作的，誰還沒有倦怠的時候呢？本應該精準定位的sgRNA也有走眼的時候，本應該識別標準PAM序列 的Cas9蛋白，也偶爾不走心，結果就是脫靶，影響了編輯的效率。
有“病”不可怕，關鍵是“對癥下藥”？
醫生治病講究對癥下藥，科研思路也不例外。找出原因解決問題，既然是sgRNA和Cas9蛋白出現了毛病，那么我們就針對不同病癥采取不同方式：
優化sgRNA
（1）改變自我：改變sgRNA 的長度，截斷5' 端的2-3 個堿基或在識別序列前加2 個鳥嘌呤，切割活性不變， 脫靶率降低5000 倍。
（2）提升自我：增加sgRNA 的穩定性。如在gRNA 中增加一對A-U 堿基配對等方法。此外， 有研究表明Cas9 直系同源酶對某些位點的特異性較SpCas9 高，這無疑為提高特異性提供了一條新思路。
提高Cas9蛋白自身特異性
專一性對于家庭是很重要，而對于CRISPR技術也是很重要。專一性一方面與自身有關，另一方面也與環境的誘惑有關，因此對于Cas9蛋白，我們要從內和外兩個因素去考慮。
（1） 擦亮眼睛，辨認出誰是你的Mr/Mrs Right：增強Cas9 蛋白對標準PAM 序列的識別能力，突變體D1135E對標準PAM 的識別更加特異，從而降低因識別非標準PAM 序列而引起脫靶。
（2）與對的人相親相愛就好，不要老是沾花惹草：將Cas9蛋白進行定點突變形成eSpCas9和SpCas9-HF1，突變體減弱了Cas9 蛋白與DNA 的非特異性結合的能力，增強靶向序列與Cas9 蛋白結合的競爭力。
（3）減少外界誘惑：調控Cas9 蛋白在細胞中的表達量。通過使用誘導型啟動子、插入4-HT 依賴的內含肽等方法構建誘導型Cas9 蛋白，減少基因組暴露于Cas9 與sgRNA 復合體的時間， 即減少Cas9 與非靶向序列的結合概率，進而降低脫靶率。
（4）斷舍離：僅保留其核酸識別能力，斷除其核酸內切酶的活性。當然對于自身也是必須的：降低HNH 或RuvC 結構域功能的突變體H840A 和D10A；構建使Cas9 蛋白喪失核酸內切酶活性，借助其他核酸內切酶實現基因編輯的CRISPRi和FokⅠ-dCas9。
百奧賽圖殺手锏——Southern blot檢測金標準
sgRNA設計嚴謹
舍棄可能脫靶到有功能基因組序列的sgRNA
純RNA注射
縮短Cas9蛋白和sgRNA的作用時間
Southern blot檢測
對大量數據統計數據分析發現，采用ES細胞方式制備，隨機插入概率約為20%，采用CRISPR/Cas9技術，大約有32%的概率有隨機插入。而這32%中有14%的隨機插入無法依靠交配傳代去除，排除隨機插入的金標準是Southern blot。百奧賽圖嚴把質量關，堅持進行Southern blot檢測，確保基因編輯獲得的動物無隨機插入。
Southern雜交的目的是為了檢測目的基因的插入位置及拷貝數量。Southern blot雜交是進行基因組DNA特定序列定位的方法，其操作過程：利用電泳分離經酶消化后的DNA片段，然后再將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經干烤或者紫外線照射固定，再與相對應結構的DIG標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。
參考：
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