34 不是所有的塞卡病毒都一樣。2017年9月, 中科院遺傳所的許執恒團隊和軍事醫學科學院的秦成峰團隊在Science上報導,prM蛋白的一個突變(S139N)增加了塞卡病毒的傳染性,并引起更嚴重的小頭癥和更高的致死率。在該論文發表后一周內,Sabeti團隊和張鋒團隊就設計、開發出幾個能區分出S139N病毒突變的SHERLOCK分析方法,包括熒光或顯色格式。圖中Ancestral或Anc代表最早起源的野生型(139S)塞卡病毒,Derived或Der代表衍生的突變型(139N),DOM代表來自多米尼加的患者, HND代表來自洪都拉斯的患者。
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35 2018年10月,在Science的又一篇論文中,Doudna團隊也用“釣魚”的方法為DETECTR技術平臺找到了一個新的工具:
Cas14。Cas14的第一個特點是它的個頭小(40-70KD),不到其它Cas酶的一半,因而大規模生產該蛋白的難度相對較低。它的第二個特點是它只靶向單鏈DNA,激活后除了剪切靶ssDNA外,還非特異性地剪切其它ssDNA。
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根據Cas14的第二個特點,他們設計了Cas14-DETECTR。由于Cas14-sgRNA只識別單鏈DNA,RPA擴增產物需要被轉變為ssDNA。他們用了一個巧妙的方法:在擴增DNA時,一對引物中只有一個含有phosphorothioate
(PT)。擴增后,沒有被PT保護的DNA鏈會被T7外切酶降解,而有PT保護的單鏈則幸存下來,繼續被Cas14-sgRNA甄選。
圖片來源:參考資料2和12
37 Cas14的第三個特點是它的識別序列沒有PAM的限制,所以可以靶向任何序列。它的第四個特點是對識別序列中間的堿基的要求很嚴格,有一個錯配就不能結合。也就是說,Cas14-DETECTR的特異性能達到單堿基,比Cas12-DETECTR的高(參照圖25)。根據這一特點,Doudna團隊用Cas14-DETECTR建立了高保真的SNP基因型分析方法。文中給的例子是區分藍色眼睛和棕色眼睛的基因型。通過調控下游的OCA2基因,人的HERC2基因中第86個內顯子的一個堿基的差別決定了眼睛顏色的差異:G是藍色,A是棕色。通過對志愿者的唾液分析,他們可以迅速、準確地查出決定眼睛顏色的SNP基因分型。圖中志愿者5-7的眼睛是藍色
(GG純和子),1-4的眼睛是棕色(1和2是AA純和子, 3和4是AG雜合子)。
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38 至此,在CRISPR分子診斷技術中最常用的三個Cas系統已全部亮相。
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