基 本 方 案 1 抗原特異性的抗體產生材 料
200ul 完全培養基重懸細胞（兩種板）。在測定前將細胞置于冰上。 基 本 方 案 2 Jerne-Nordin PFC 測定法材 料2 X R P M I 1640 培養基中含碳酸氫鹽（Invitrogen) SeaPlaque 低 熔 點 瓊 脂 糖（F M C BioProducts)
 5.—次 分 配 50 ul T N P -S R B C 到 6?8 管中。檢 測 1 或 2 張玻片，將混合物倒在玻片上并沿管子邊緣擴散開（玻片是橙紅色）。 6 .從洗滌過的培養板中的第一孔轉移 IOOul 細 胞 出 來（如果用多克隆刺激劑可用小點的體積，如 20?50ul; 如果誘導劑很弱可以用大點的體積，如 120ul)，吹打孔底多次使得所有的細胞都轉移到含瓊脂糖的第一管中。 7 .將水浴中的玻璃管拿出，緊握住玻璃管防止濺出內容物，用 有 2 片紗布的橡皮墊的混和器混旋。顛倒玻璃管將混合物倒入第一張玻片。迅速通過玻璃管管口擴散瓊脂糖于玻璃表面上。 8 . 重復步驟 6 和 7 處 理 完 1 0 個管子；在玻片干之前不能移動，也不能使它們表面向上太長時間否則會干掉。在第一批 5?1 0 個玻片做好之后，將它們上面朝下放在自制的玻片盒上。 9 . 剩余的玻璃管和玻片重復步驟 5?8 直到所有的培養物都從管內轉移到玻片上。 10.將 玻 片 盒（或玻片架和染色缸）重疊起來，將另外一個玻片盒放在上面，用濕布和大 塑 料 袋 蓋 上（后者可選）。 11.在 無 C O 2 的 37°C 環境下培養 lh。 12.用 D P B S 稀 釋 豚 鼠 補 體（通常每個玻片盒需要 48 ml 1 : 2 0 或 1 : 2 5 稀釋的補體），溫 和 混 勻（不要劇烈振蕩），維 持 在 37°C 的環境下。 13.從玻片盒外去除濕布。用 IOml 或 20m l 移液管將稀釋的補體從玻片的一端淹沒玻片 ，移液管頭要接近玻片的邊緣，確保在玻片下沒有氣泡。 14.在無 C O 2 的 37°C 環境下培養 lh。 15.將玻片輕輕放在玻片架上，然后將玻片架浸泡在含有 0.85% (m /V ) 的氯化鈉的染色缸中。 16.立即觀察玻片或在 4°C 保存幾個小時后觀察。并 在 低 倍 雙 目 解 剖 顯 微 鏡（放 大 10倍）下用間接光照亮瓊脂糖層計數空斑數目。空斑在瓊脂糖的 S R B C 層里顯現成色圈樣。如果在空斑處看到了顆粒，那么認為這是個假空斑 基本方案 3 Cunningham-Szenberg PFC 測定法適當的吸收豚鼠補體對這項檢測很重要。并 且 ，補體溶化后應該立即使用，不要再次凍存。所有的試劑應于室溫時使用以避免在小室中形成氣泡。玻片小室應該在灌滿之后 的 20m i n 內用蠟封起來以避免干燥。 材 料蠟（組織制備級） 含添加物的 R P M I 或 IF1 2 完全培養基 7.5% (V7 V ) S R B C 或 1 5 % T N P - S R B C (見輔助方案 3) 從培養細胞中洗滌的 B 細 胞（見基本方案 1) 完全培養基里的 5 0 % (V /V ) 豚 鼠 補 體（如 Life Technologies， ColoradoSerum) 120 cm2 玻璃培養皿 9 6 孔 U 形底微量滴定板
 的 角 上（圖 2.5. 2A )。 轉 移 的 細 胞 數 目 應 該 調 整 為 不 多 于 75? IOOPFC/ 小 室 。 4.將它們浸沒在熱蠟中使小室的兩邊封閉（步 驟 1)。將玻片放置于玻片架上或 C O 2 培養箱的托盤上。并 在 37°C 條件下培養 lh。 5.用肉眼或者用 1 0 倍解剖顯微鏡計數空斑（通過模糊的邊緣和沒有反射性的特性與氣泡相區別；圖 2.5. 2B )，輕輕移動玻片防止搖晃，避免擾亂單層。
 輔 助 方 案 1 制備瓊脂糖包被的玻片材 料7 0 % 乙 醇 SeaPlaque 低 熔 點 瓊 脂 糖（F M C Bioproducts) 一端磨砂的載玻片（如 Gold Seal Rite-O N 載玻片， Fisher) 玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher) 烤箱 IOOml 玻璃瓶 43°C 水浴 載玻片盤
輔 助 方 案 2 制 備 Cunningham-Szenberg 小室材料7 0 % 乙醇 3inX I in X 0.93? 1.05 mm 載玻片 玻 片 架 和 染 色 缸（Fisher) 干烤箱 0.25in 雙 面 膠（如 3M ) 滾 筒（如 25m l 移液管或者類似的圓形物體） 1.將 3in X l in X 0. 93? 1.05m m 載玻片放于玻片架上。將 它 轉 移 至 含 7 0 % 乙醇的染色缸內浸泡。移出玻片架將玻片在干烤箱內干燥 l 〇 m in。 然后使玻片冷卻至室溫。 2.將 15?3 0 個玻片靠近排放，但是互相不接觸。 3.將 0. 25in 雙面膠貼于玻片兩端和玻片的中間使得玻片被分成了兩個 100/xl 部 分（圖2. 5. 2A ) 4.撕開雙面膠的背面，將另一個玻片對齊粘上。 5.用滾筒輕輕地壓玻片以使雙面膠貼牢。使用的時候用刀片裂開玻片之間的膠帶。 輔 助 方 案 3 三 硝 基 苯 半 抗 原（TNP) 偶 聯 SRBC材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)雙 甘 氨 肽（改良的巴比妥緩沖液） l X M B B 2 ，4,6-三 硝 基 苯 磺 酸（T N B S ) ，鈉鹽 O .28mol/L 二甲砷酸鹽緩沖液， p H 6. 9
 輔 助 方 案 4 蛋 白 質 A 偶 聯 SRBC材 料
輔 助 方 案 6 用 Percoll 梯度離 心純 化 靜息 B 細胞材料IX 和 IOX Hanks 平 衡 鹽 溶 液（H B S S ) ，不 含 鎂（Life Technologies)， 4°C
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