ABSciex視頻講座“QTRAP系統進行代謝物鑒定方法”

　　3月24日，AB Sciex 公司在分析測試百科網成功舉辦了題為“在藥物發現和開發階段代謝物鑒定的高級解決方案”的網絡視頻講座。AB Sciex 的資深應用專家張克榮老師簡單介紹了代謝物鑒定的應用和儀器概述，隨后重點講解用QTRAP^?系統進行代謝物鑒定的方法。

　　代謝物鑒定的應用和儀器概述

　　代謝物的鑒定在發現和研發階段一般采取LC-MS/MS的方法，2001年發布的代謝物測定的策略是：樣品進入儀器后，采用串聯四極桿的母離子掃描和中性丟失掃描進行代謝物發現，隨后使用線性離子阱和三重四級桿做二級圖譜，對發現的代謝物進行確證，可以完成80%的工作，使用線性離子阱的多級功能可以進一步確認代謝物，剩下的5%-10%的工作是用Q-Tof的精確質量數分析得到進一步的確證。這個分析過程需要多種質譜和多次進樣。

　　到了今天，代謝物鑒定使用高精確質量數的儀器Q-TOF或者Orbitrap進行掃描，三重四級桿的母離子掃描和中性丟失掃描以及串聯四極桿的MRM的模式發現代謝物，利用QTRAP^?得到二級圖譜進行代謝物鑒定。

QTRAP 5500 四極桿-線性阱復合型質譜儀

3200 Qtrap 四極桿-線性阱復合型質譜儀

4000 Qtrap四極桿-線性阱復合型質譜儀

　　QTRAP由3個四極桿組成，特殊性在Q3，Q3既可以作為四極桿使用也可以作為線性離子阱來使用，因此具有這兩個儀器的特點。QTRAP的工作原理就是，Q0中第一次捕獲、富集離子，Q1中選擇母離子，Q2中碰碎，Q3捕獲、富集后質量掃描。采用多重EPI（增強子離子掃描）可以檢測共流出的代謝物。經過試驗發現QTRAP的EPI全掃描的靈敏度比普通PI（子離子掃描）的靈敏度高出500倍，即使含量很低的物質也可以檢測出來。

　　QTRAP除了具有串聯四極桿和離子阱的所有功能外，信息關聯采集的功能也可以保證切換快速完成，發現代謝物的同時也能夠進行確證工作。經過比較可以看到pMRM的掃描模式在體內和體外代謝物檢測時靈敏度、選擇性都很優秀，代謝物的覆蓋率也很好。

　　QTRAP^?系統的掃描模式都包含在LightSight^? v2.2軟件中。使用該軟件可以建立MRM、母離子丟失、中性離子丟失和EMS的掃描方法，軟件和儀器連接，圖譜可以自動添加，選擇創建采集方法，能夠自動得到分析結果。張老師舉例向大家展示，LightSight 軟件窗口一個工作區內，軟件自動關聯MS和MS/MS，對數據能夠進行快速瀏覽，而且也方便對代謝物和母藥MS/MS圖譜的比較而進行代謝物結構鑒定。

　　QTRAP系統進行代謝物鑒定的方法

　　1、目標代謝物的鑒定方法

　　張老師以pMRM(預見的MRM檢測)和IDA分析方法對大鼠靜脈給藥1mg/kg維拉帕米的代謝物檢測為例來介紹QTRAP對目標代謝物的鑒定。

　　維拉帕米分子結構容易發生氧化和去甲基化，不同位置發生不同的反應后經過Q1、Q3會得到不同的質量峰。維拉帕米給藥2小時以后大鼠的膽汁和尿樣使用QTRAP進行測定，200多個離子對2.4s 就可以完成一個循環測定，在尿樣中，pMRM檢測維拉帕米代謝物得到色譜圖后，可以自動給出二級圖譜進行代謝物鑒定。使用pMRM-EPI方法，一次進樣能夠檢測到23個維拉帕米的代謝物，使用3個EPI，多個共洗脫代謝物也可以被檢測到，保證主要代謝物沒有遺漏。

　　2、非目標代謝物的鑒定方法

　　張老師以使用MIM方法對奈法唑酮代謝物鑒定為例介紹了QTRAP進行非目標代謝物的鑒定方法。非目標代謝物檢測時由于不知道代謝物類型，因而不能使用預測pMRM的方法，使用MIM方式或者Q3全掃描，MS判斷同位素分布，使用IDA自動給出二級圖譜。MIM是2008年Ming Yao博士提出的，就是在Q1時選擇離子，Q2時只給一個很低的能量讓其通過，Q3中進行檢測。MIM的靈敏度優于全掃描，與MRM相當，適合低含量非目標代謝物的檢測。

　　MIM掃描方式可以進行高通量代謝柔點分析，在數據后處理時可以采用EIC、PIF或者NLF方法進而發現待測的代謝物。以鼠肝中奈法唑酮代謝物檢測為例，在二級質譜圖中可以發現有一個中性丟失。MIM-EPI圖譜就可以確定奈法唑酮的代謝物。使用QTRAP的MIM的方式可以發現奈法唑酮所形成的常見和不常見的代謝物。

　　3、多重母離子掃描/中性丟失結合正負極性切換

　　GSH即谷胱甘肽，它是一種三肽，容易結合在藥物的反應點，在體內和體外藥物結合時可能成為一種有毒性反應的標記，因此藥物開發階段低濃度的GSH的結合物的檢測尤為重要。利用LC/MS/MS高靈敏度和高選擇性來檢測藥物的活性代謝物與GSH結合物。

　　谷胱甘肽在ESI模式下容易發生中性丟失失去一個129的分子結構，而在負離子模式下失去一個272的碎片。使用QTRAP系統分析雙氯芬酸活性代謝物鑒定中，經過正負模式轉換，分析得到的圖譜就可以進一步確定雙氯芬酸的GSH結合物。

　　最后張老師總結了QTRAP在代謝物研究中的應用范圍。AB Sciex 的QTRAP可以實現一機多用，獨特的母離子/中性丟失/MRM-EPI功能，高通量，高易用性，使得QTRAP非常適合藥物代謝的研究領域。

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　　問題與答案：

　　網友：pMRM預測得到的代謝物怎么驗證呢?

　　張克榮老師：待測物的轉換類型在進行預測MRM的同時，還進行EPI掃描方式，得到二級全掃描來進一步確證預測的代謝物。

　　網友：為什么在分析雙氯酚酸時，使用ER功能呢?

　　張克榮老師：雙氯芬酸與GSH結合物檢測時有一個正負離子切換掃描的過程，通過ER去確定掃描某一時間點的質量數來進行下一步二級全掃描。

　　網友：QTRAP的離子阱功能和真正的離子阱功能有什么差別?

　　張克榮老師：離子阱的工作原理決定了分析中低質量碎片看不到，并且碎裂效率低，QTRAP在四極桿中碰碎母離子，碰撞效率高，而且不存在離子阱的1/3效應。

　　網友：四級桿實現離子阱功能是怎么實現的?

　　張克榮老師：在Q3兩端加上2個電壓，在四極桿上加上一個軸向電壓，當離子進入以后，不進行掃描，而在Q3中進行捕獲，由此做出的改進。

　　

　　網友：pMRM-EPI的方式其他類型的儀器可以實現嗎?QTRAP的優勢在哪兒?

　　張克榮老師：pMRM-EPI的方式只有QTRAP類型儀器可以做。QTRAP的優勢在于做MS/MS全掃描時，靈敏度比三重四極桿高兩個數量級以上。

　　網友：研究天然中藥提取物如皂苷類化合物代謝物時，可能質譜打到MS3時尚無法確定母核其他基團的取代位點，有什么解決辦法呢

　　張克榮老師：QTRAP類型儀器在做MS/MS掃描時，可通過調節Q2中的碰撞能量獲得豐富的碎片，然后對其主要碎片進一步做MS3來歸屬碎片是從母體藥物直接碎裂還是從某一碎片碎裂，從而對離子碎片進行歸屬，來確定化合物結構。

　　網友：pMRM預測得到的代謝物怎么驗證呢?

　　張克榮老師：根據同時得到的MS/MS圖譜來進一步驗證。

　　網友：為什么在分析雙氯酚酸時，使用ER功能呢?

　　張克榮老師：實例中提到的是研究雙氯酚酸的谷胱甘肽代謝物，研究谷胱甘肽代謝物時，試驗方法為 (+)NL 129/ (-)PI 272 –(+)ER-IDA-(+)EPI試驗方法，因為EPI為正離子模式，母離子掃描(PI)是在負離子模式下，通過ER掃描，可計算出負離子模式下找到的離子在正離子模式下的質量數，從而進一步在正離子模式下進行EPI。

　　網友：請問張老師，PIF和NLF是如何實現的?謝謝

　　張克榮老師：是通過AB SCIEX儀器控制軟件Analyst中Script項下的IDATraceExtractor實現的。

　　網友：QTRAP的離子阱功能和真正的離子阱功能有什么差別，四級桿實現離子阱功能是怎么實現的，謝謝!

　　張克榮老師：QTRAP的離子阱做MS/MS時碎裂在Q2碰撞室中，與真正的離子阱相比，沒有1/3效應，碰撞效率高。

　　網友：MIM與SIM的異同點，MIM如何實現，謝謝您!

　　張克榮老師：MIM是類同于MRM，經過Q1和Q3兩個質量分析器選擇分析。SIM是單通過Q1質量分析器選擇或Q3選擇進行檢測分析。

　　網友：請問老師，pMRM與MIM相比，哪個更有優勢?

　　張克榮老師：各有優缺點，應用方向不一樣，pMRM主要用于做目標代謝物研究，MIM是側重與非目標代謝物研究。

　　網友：如果沒有sightlight軟件，可以使用pMRM功能嗎?

　　張克榮老師：可以。AB SCIEX的儀器控制軟件Analyst軟件也有此功能。

　　網友：請教張老師，獲取雙氯酚酸的數據時，可不可以使用同位素激發-EPI?

　　張克榮老師：可以在IDA Isotope pattern中設定同位素分布，滿足此同位素分布的可優先選擇觸發EPI。

　　網友：能從電路等設計上說明一下嗎，你沒有解釋四級桿怎么實現的離子阱，如果僅僅是捕獲實現離子阱功能，它的效率應該步入正真離子阱

　　張克榮老師：Q3的出口加了透鏡隔板，在Q3上加了兩個Collar Lens，Q3的兩個桿上加auxiliary RF。

　　網友：MIM的自動計算小軟件是怎么回事呢?

　　張克榮老師：是通過EXCEL自動建立MIM離子對。

　　網友：如果是三重四級桿，沒有QTRAP，可以做pMRM嗎

　　張克榮老師：可以做pMRM，但不能同時得到MS/MS圖譜。由于三重四極桿的MS/MS靈敏度低。

　　網友：剛才說的MIM功能，第一個Q選擇離子，第二個Q通過，第三個Q再檢測選擇的例子，但是我記的講座中的MIM是預測未知代謝物，或未知化合物的，如果是未知，怎么知道選擇離子的質量數

　　張克榮老師：MIM是研究非目標代謝物研究，是設定包含一個質量范圍內的所有離子來進行研究，Q1和Q3質量數是相同的。

　　網友：pMRM模式要在QTRAP上作嗎，普通3Q怎么做

　　張克榮老師：pMRM-EPI是盡在QTRAP能實現。普通3Q只能做pMRM，AB SCIEX的Analyst軟件中有此功能。

　　網友：剛才網友提到可以同位素激發，請問如何實現同位素激發?

　　張克榮老師：可以在IDA Isotope pattern中設定同位素分布，滿足此同位素分布的可優先選擇觸發EPI。

　　網友：MIM時我們如何選 擇Q1，不是不知道目標化合物嗎

　　張克榮老師：是設定包含一個質量范圍內的所有離子來進行研究

　　網友：剛才您說，MIM比pMRM好，是指它獲得的譜圖更好、靈敏度更好么?pMRM是不是速度更快些?

　　張克榮老師：不能說MIM比pMRM好或不好，兩者各有優缺點，應用方向不一樣，pMRM主要用于做目標代謝物研究，MIM是側重與非目標代謝物研究。

　　網友：MIM的方式，是不是靈敏度較差,所以適合體外研究?那么PMRM/MIM-EPI，會不會影響掃描效率?因為MIM掃描的離子對很多。

　　張克榮老師：MIM靈敏度高于全掃描，可用于體內、體外研究。pMRM/MIM-EPI不會影響掃描效率，利用兩者結合可代謝物的覆蓋更全面。

　　網友：QTOF能做MIM嗎?

　　張克榮老師：不能

　　網友：如果沒有MIM的自動計算小軟件，我們該怎么做MIM呢?

　　張克榮老師：只能自己手動輸入了。

　　網友：是MIM比SIR好嗎?

　　張克榮老師：兩者不是一個概念。和離子阱的掃描模式EPI一起用，MIM-EPI要好于SIM.

　　網友：容量達到10的五次方，四級桿的質譜，是要加端蓋電壓的，離子不可能在一定的軌道上，所以離子容量不可能比離子阱高，能有深度的解釋一下嗎，講座中

　　張克榮老師：這個問題能說的更明白些嗎?我不是很理解。謝謝!

　　網友：課件可以發給我們一下嗎?

　　張克榮老師：課件可到http://www.absciex.com.cn/webinar.asp網站下載。謝謝!或登錄分析測試百科網下載講座視頻。

　　更多問題網友可以通過郵箱和張克榮老師聯系，張老師郵箱：kerong.zhang@absciex.com

　　本次講座的PPT錄音文件參見網址：http://www.antpedia.com/corp/data-986.html