5.2.1甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳

10XMOPS 電泳緩沖液甲醛甲酰胺10X 加樣緩沖液溴化乙錠瓊脂糖DEPC 處理的水

水平電泳裝置水浴

(一）材料與設備

1) 水平電泳裝置

2) 水浴

3)10XMOPS 電泳緩沖液：0.2mol/LMOPS(PH7.0)，20 mmol/L 乙酸鈉，10 mmol/LEDTA(pH8.0)

4) 甲醛;37% 溶液（13.3mol/L)

5) 甲酰胺（去離子）：將 10 ml 甲酰胺和 lg 離子交換樹脂混合，攪拌 lh 后用 Whatman 濾紙過濾，等分成 1 ml 于一 70°C 儲存。

6）10X 加樣緩沖液：10 mmol/LEDTA(pH8.0)，0,25% 溴酚藍，0.25% 二甲苯青，50% 甘油

7) 溴化乙錠

8）瓊脂糖

9)DEPC 處理的水


(二）操作方法

1) 凝膠制備：制 100 ml. 含冇 2.2mol/L 甲醛和 1I.5% 瓊脂糖凝膠。將 1.5 g 瓊脂糖溶解在 72 ml. 水屮，微波爐加熱溶解后冷卻到 55X：, 加入 10 ml10XMOPS 電泳緩沖液和 18 mL, 去離子甲醛，然后灌膠。

2) 樣品制備；分光光度下測以確定的濃度。如果 RNA 濃度太低 (<lmg/ml)，可用乙醇或異丙醇沉淀濃縮。

3) 電泳：在 l.5 mL 的離心管中加入下列組分進行變性反應，

RNA〔最多 20ug）                                            2ul

10XMOPS                                                          2ul

甲醛                                                                   4ul

甲酰胺                                                              10ul

溴化乙錠（200ug/ml)                                        1ul

混勻后，于 55℃ 保溫 60 min 使 RNA 變性，冰中冷卻 110 min, 離心，加 2ul10X 加樣緩沖液混勻，置于冰上，上樣電泳，用1XMOPS 作電泳緩沖液，直到溴酚藍到達凝膠的底部。在紫外燈下觀蔡結果。

4)RNA 的分子質量標記。①使用商品化 RNA 分子的大小標準.②利用細胞中兩個主要核糖體 RNA:18S(約 2.lkb) 和 28S(約 4.5kb) 作分子質量參照。

1) 為了獲得高分辨率. 可以在凝膠中加入更多的甲酵. 以較低的電流如 20mA 電泳過夜。在冷室中跑膠或用循環泵防止過熱，但不必一定如此。

2) 對樣品的染色也可在電泳后進行，將凝膠置于溴化乙錠溶液（0.5ug/ml) 中染色 10 min?如果背景過高可在水屮脫色 30 min。

3) 含甲醛的瓊脂糖凝膠較普通膠脆，應小心操作。

4) 在含甲醛的瓊脂糖凝膠上,RNA 比等長的 DNA 遷移速度快，一般不用 DNA 標準分子質量參照物測量未知分子大小。

5) 用于 RNA 電泳的電泳槽要用去污劑溶液洗凈，再用水沖洗，用乙醇干燥后再灌滿 3% 的過氧化氫，于室溫放置 10 min 后，再用 DEPC 處理的水徹底沖洗電泳槽。