2.8.1流感病毒RNA提取

10×RSB 溶液10%SDS蛋白酶 KlOXLiCI 溶液RSB 飽和的酚氯仿異戊醇2mol L 乙酸鈉 無水乙醇TSE 溶液LiCl 緩沖液平衡酚TSE 飽和酚4mol LLiCL

一 材料與設備

1. 酚提法

1)10×RSB 溶液：O.Olmol/LTris，O.OOlmol/LKCl,0.0015mol/LMgCL2

2)10%SDS

3) 蛋白酶 K，5 mg/ml

4)lOXLiCI 溶液:5%SDS，0.lmol/L 乙酸鈉，1.4mol/LLiCl。

5)RSB 飽和的酚.

6) 氯仿：異戊醇 (24:1)

7)2mol/L 乙酸鈉。

8) 無水乙醇。

2.LiCl 提取法

1)TSE 溶液。

2)10%SDS,

3) 蛋白酶 K(10 mg/ml)。

4)lOXLiCl 溶液：5%SDS，0.lmol/L 乙酸鈉，1.4mol/LLiCl

5)LiCl 緩沖液平衡酚

6) 氯仿

7)2mol/L 乙酸鈉

8) 無水乙醇，

3) 酚-SDS 提取法

1)TSE 溶液

2)10%SDS

3)TSE 飽和酚

4)4mol/LLiCL

5)2mol/L 乙酸鈉。

6) 無水乙醇。

二 操作方法

1. 酚提法


1) 在 4 ml 純化病毒懸液中加 1/10 容量 1OXRSB，0.12 ml10%SDS，0,4 ml 蛋白酶 K, 置 56℃15 min

2) 在上述溶液中加 0.8 mllOXLiCl 溶液和 4 ml 用 RSB 飽和的酚，56°C 振搖 5 min, 立即冰浴。

3) 加 4 ml 氯仿：異戊醇（24:1)，室溫搖 15 min,3000r/min，離心 10 min。

4) 取上層水相，再加 4 mlRSB 飽和酚和 4 ml 氯仿：異戊醇，如此重復 1?2 次

5) 取上層水相，加 0.1 倍體積的 2mol/L 乙酸鈉，2.5 倍體積的無水乙醇,-20℃ 或-70℃ 下保存。


2.LiCl 提取法


1) 純化病毒重懸于 2 mlTSE 中，加 70ul10%SDS(終濃度為 0.3%), 再加 100ul 蛋白酶 K(10 mg/ml)，置 56℃ 下 15 min。

2) 加 0.2 ml10XLiCl 緩沖液，1 ml 用 LiCl 緩沖液平衡的酚溶液，輕揺，2000r/mm 離心 5 min

3) 取上層酚相，加 0.5 ml1XLiCl 溶液，提取 1 次，2000r/min 離心 5 min

4) 取上層水相與 3) 中所得到的下層水相混合，再加 1.2 mlLiCl 平衡的酚，輕搖，2000r/min 離心 5 min。

5) 棄上層酚相，加 1.2 ml 氯仿，輕揺，2000r/min 離心 5mim。

6) 取上層水相，加 0.05 倍體積 2mol/L 乙酸鈉倍體積的無水乙醇，在-20°C 或-70℃ 保存


3. 酚-SDS 提取法


1) 將純化病毒重懸于 2 mlTSE 中，加 0.2 ml10%SDS，輕搖至懸液澄清為止。

2) 加 2 mlTSE 飽和酚，在冰浴中輕搖 5 min,3000r/mim 離心 lOmin。

3) 取上層水相，再用 TSE 飽和酚提取 2?3 次。

4) 取上層水相，加 100ul4mol/LLiCl，0.05 倍體積 2mol/L 乙酸鈉，2.5 倍體積的無水乙醇，在-20°C 或-70℃ 下保存。