魏文勝：CRISPR功能性篩選新方法

　　自2013年Science雜志將CRISPR技術選為年度突破開始，這一新技術就給基因編輯世界帶來一場風暴：在過去的這一年半時間里，CRISPR方法已迅速席卷了整個動物王國，成為DNA突變和編輯的一種明星技術。

　　國內外各大生物實驗室的科學家們紛紛嘗試利用這種技術進行攻關，近期來自北京大學生命科學學院的研究人員就取得了一項階段性的重要成果，開發了一種基于 CRISPR/Cas9系統的慢病毒聚焦型人源細胞文庫、功能性基因篩選平臺以及基于高通量深度測序技術解析數據的完整技術路線。

　　那么這一套技術路線是什么?相對于其它方法有哪些優勢?這項研究對于基礎研究和臨床研究又具有哪些意義呢?為此生物通特聯系了領導這一研究的魏文勝研究員，就讀者感興趣的問題請教了他。

　　明星技術CRISPR/Cas9系統

　　近年來基因組編輯領域取得飛速的發展，鋅指核酸酶(ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)、CRISPR/Cas系統大大改變了科研人員在哺乳動物系統中研究基因及其功能的方式。

　　CRISPR/Cas系統最初被發現是細菌和古細菌為抵御病毒和質粒不斷攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。在II型CRISPR/Cas系統中，Cas9內切酶家族在單導向RNA (single-guide RNA，sgRNA)引導下靶向和剪切外源基因，生成DNA雙鏈斷裂(DSBs)。CRISPR/Cas系統系統的高效基因組編輯功能已被應用于多種生物，包括人、小鼠、大鼠、斑馬魚、秀麗隱桿線蟲、植物及細菌。相比于ZFNs和TALEN, CRISPR/Cas系統介導的基因組靶向實驗在真核細胞中具有相似甚至更高的效率。

　　在這項最新研究中，魏文勝研究員就是采用了這一系統，開發了一種慢病毒聚焦型人源細胞文庫、功能性基因篩選平臺，并由此結合高通量深度測序技術，獲得了一種高效的新型遺傳篩選技術。

　　魏文勝研究員表示，“CRISPR/Cas9技術是造成基因完全敲除來產生表型差異，而RNA干擾是基因表達的下調，概念上完全不同。所以前者可以很好的解決后者的問題。 而TALENs不適合，因為TALENs work in pairs, 而且不能通過慢病毒侵染方式建庫(會發生重組突變)”。

　　新型遺傳篩選技術鑒定宿主受體

　　構建這一套高效的遺傳篩選技術，“簡單的講，包括預先建立穩定表達Cas9(以及OCT1)的細胞系并確定sgRNA能夠在該細胞系實現基因修飾；建立sgRNA慢病毒文庫以及細胞文庫；功能性篩選和富集；PCR擴增和深度測序分析；數據分析及候選基因的驗證 等等”，魏文勝研究員解釋道。

　　通過這一套技術，魏文勝研究員和他的同事成功地鑒別出了對于炭疽和白喉毒素毒性至關重要的宿主基因，并在隨后的細胞實驗中對這些候選基因進行了進一步的功能驗證。

　　研究發現了與病菌侵染宿主蛋白及通路有關的基因，這將為對抗病菌提供了新型藥物靶點 ，而且更重要的是，這一強大的高通量基因篩選技術的建立可以用于廣泛的生物學問題研究，惠及眾多生物醫學相關研究領域。

　　具體來說，這種基于CRISPR的策略結合深度測序分析適用于功能基因組學研究，廣泛地利用這一強有力的遺傳篩選策略，將能進一步地推動以一種高通量的方式應用CRISPR/Cas系統開展基因功能研究，不僅能夠快速地鑒別對細菌毒性至關重要的基因，還將促成發現參與其它生物過程的基因。

　　同時，這項具有里程碑意義的工作與已經在Science雜志發表的兩篇主題相近的文章比較，該工作所報道的方法具有更為廣泛的細胞系適應性，對于功能性基因的篩選和鑒定具有十分重要的意義。