高通量測序(NGS)的過程及原理介紹

　　高通量測序技術的一般過程是將DNA（或cDNA）隨機片段化，加上接頭序列，制備用于上機測序的文庫，通過對文庫中數以萬計的克隆（colony）進行延伸反應，檢測對應的信號獲取序列信息，最終通過數據分析來挖掘序列中的科學問題。

幾種不同測序平臺的原理及步驟如下：

（1）Roche 454平臺

　　Roche 454測序系統是第一個商業化運營二代測序技術的平臺，也是首選將焦磷酸測序應用在測序技術上的平臺。測序原理如下：

1）DNA文庫制備

　　454測序系統的文件構建方式和illumina的不同，它是利用噴霧法將待測DNA打斷成300-800bp長的小片段，并在片段兩端加上不同的接頭，或將待測DNA變性后用雜交引物進行PCR擴增，連接載體，構建單鏈DNA文庫。

2）Emulsion PCR （乳液PCR，其實是一個注水到油的獨特過程）

　　454當然DNA擴增過程也和illumina的截然不同，它將這些單鏈DNA結合在水油包被的直徑約28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。

　　乳液PCR最大的特點是可以形成數目龐大的獨立反應空間以進行DNA擴增。其關鍵技術是“注水到油”（水包油），基本過程是在PCR反應前，將包含PCR所有反應成分的水溶液注入到高速旋轉的礦物油表面，水溶液瞬間形成無數個被礦物油包裹的小水滴。這些小水滴就構成了獨立的PCR反應空間。理想狀態下，每個小水滴只含一個DNA模板和一個磁珠。

　　這些被小水滴包被的磁珠表面含有與接頭互補的DNA序列，因此這些單鏈DNA序列能夠特異地結合在磁珠上。同時孵育體系中含有PCR反應試劑，所以保證了每個與磁珠結合的小片段都能獨立進行PCR擴增，并且擴增產物仍可以結合到磁珠上。當反應完成后，可以破壞孵育體系并將帶有DNA的磁珠富集下來。進過擴增，每個小片段都將被擴增約100萬倍，從而達到下一步測序所要求的DNA量。

3）焦磷酸測序

　　測序前需要先用一種聚合酶和單鏈結合蛋白處理帶有DNA的磁珠，接著將磁珠放在一種PTP平板上。這種平板上特制有許多直徑約為44um的小孔，每個小孔僅能容納一個磁珠，通過這種方法來固定每個磁珠的位置，以便檢測接下來的測序反應過程。

　　測序方法采用焦磷酸測序法，將一種比PTP板上小孔直徑更小的磁珠放入小孔中，啟動測序反應。測序反應以磁珠上大量擴增出的單鏈DNA為模板，每次反應加入一種dNTP進行合成反應。如果dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團。釋放的焦磷酸基團會與反應體系中的ATP硫酸化學酶反應生成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化使測序反應中的熒光素分子并發出熒光，同時由PTP板另一側的CCD照相機記錄，最后通過計算機進行光信號處理而獲得最終的測序結果。由于每一種dNTP在反應中產生的熒光顏色不同，因此可以根據熒光的顏色來判斷被測分子的序列。反應結束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，從而導致熒光淬滅，以便使測序反應進入下一個循環。

　　由于454測序技術中，每個測序反應都在PTP板上獨立的小孔中進行，因而能大大降低相互間的干擾和測序偏差。454技術最大的優勢在于其能獲得較長的測序讀長，當前454技術的平均讀長可達400bp，并且454技術和illumina的Solexa和Hiseq技術不同，它最主要的一個缺點是無法準確測量同聚物的長度，如當序列中存在類似于PolyA的情況時，測序反應會一次加入多個T，而所加入的T的個數只能通過熒光強度推測獲得，這就有可能導致結果不準確。也正是由于這一原因，454技術會在測序過程中引入插入和缺失的測序錯誤。

（2）Illumina Solexa平臺

　　Illumina公司的Solexa和Hiseq應該說是目前全球使用量最大的第二代測序機器，這兩個系列的技術核心原理是相同的，都是采用邊合成邊測序的方法，它的測序過程主要分為以下4步：

　　Illumina Solexa原理：橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

①DNA文庫制備——超聲打斷加接頭

　　利用超聲波把待測的DNA樣本打斷成小片段，目前除了組裝之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打斷成200-500bp長的序列片段，并在這些小片段的兩端添加上不同的接頭，構建出單鏈DNA文庫。

②Flowcell——吸附流動DNA片段

　　Flowcell是用于吸附流動DNA片段的槽道，當文庫建好后，這些文庫中的DNA在通過flowcell的時候會隨機附著在flowcell表面的channel上。每個Flowcell有8個channel，每個channel的表面都附有很多接頭，這些接頭能和建庫過程中加在DNA片段兩端的接頭相互配對（這就是為什么flowcell能吸附建庫后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面進行橋式PCR的擴增。這樣就形成了數千份相同的單分子簇，被用做測序模板。

③橋式PCR擴增與變性——放大信號

　　橋式PCR以Flowcell表面所固定的接頭為模板，進行橋形擴增，如圖4.a所示。經過不斷的擴增和變性循環，最終每個DNA片段都將在各自的位置上集中成束，每一個束都含有單個DNA模板的很多分拷貝，進行這一過程的目的在于實現將堿基的信號強度放大，以達到測序所需的信號要求。

④測序——測序堿基轉化為光學信號

　　測序方法采用邊合成邊測序的方法。向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4中dNTP（如同Sanger測序法）。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。接著，再加入激發熒光所需的緩沖液，用激光激發熒光信號，并有光學設備完成熒光信號的記錄，最后利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基。這樣熒光信號記錄完成后，再加入化學試劑淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便能進行下一輪的測序反應。Illumina的這種測序技術每次只添加一個dNTP的特點能夠很好的地解決同聚物長度的準確測量問題，它的主要測序錯誤來源是堿基的替換，目前它的測序錯誤率在1%-1.5%之間，測序周期以人類基因組重測序為例，30x測序深度大約為1周。

（3）ABI Solid平臺

　　Solid測序技術是ABI公司于2007年開始投入用于商業測序應用的儀器。它基于連接酶法，即利用DNA連接酶在連接過程之中測序，其流程及原理如下：

1）DNA文庫構建

　　片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構建單鏈DNA文庫。

2）Emulsion PCR

　　Solid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統來說則要小得多，只有1um。在擴增的同時對擴增產物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區域（圖6-a）。Solid系統最大的優點就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統中輕松實現更高的通量。

3）連接酶測序

　　這一步是Solid測序的獨特之處。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3’-XXnnnzzz-5’。連接反應中，這些探針按照堿基互補規則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標記了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM這4種顏色的熒光染料（圖6-a）。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據種類的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的熒光標記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6-a和圖6-b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關系。在記錄下熒光信號后，通過化學方法在第5和第6位堿基之間進行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進行下一個位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第1、2位，第二次是第6、7位……在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n-1進行第二輪測序。引物n-1與引物n的區別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6-a. 8）。也即是，通過引物n-1在引物n的基礎上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第5、6位……第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。該技術的讀長在2×50bp，后續序列拼接同樣比較復雜。由于雙次檢測，這一技術的原始測序準確性高達99.94%，而15x覆蓋率時的準確性更是達到了99.999%，應該說是目前第二代測序技術中準確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發生錯誤就容易產生連鎖的解碼錯誤。

（4）Thermo Fisher Scientific Ion Torrent平臺

　　Ion Torrent 測序儀是第一個不需要光學系統的商業測序儀，所采用的技術為半導體測序，通過半導體芯片直接將化學信號轉換為數字信號，不同于前面提到的任何測序儀，可以稱之為“二代半”測序儀。其測序原理如下：

　　該技術使用了一種布滿小孔的高密度半導體芯片，一個小孔就是一個測序反應池。在半導體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，當DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA鏈上時，會釋放出一個氫離子，反應池中的PH發生改變，位于池下的離子感受器感受到H+離子信號，H+離子信號再直接轉化為數字信號，從而讀出DNA序列。如果檢測的DNA鏈上有兩個相同的堿基，將會檢測到電壓雙倍，芯片則記錄兩個相同的堿基。

　　a.測序流程圖，b.文庫制備，c.乳液PCR（前三個步驟與454技術類似），d. 測序過程

　　Ion Torrent半導體測序技術的發明人也是454測序技術的發明人之一——Jonathan Rothberg，它的文庫和樣本制備跟454技術很像，甚至可以說就是454的翻版，只是測序過程中不是通過檢測焦磷酸熒光顯色，而是通過檢測H+信號的變化來獲得序列堿基信息。由于對對個相同堿基的判讀是通過電信號來傳導，Ion Torrent平臺在聚合酶上進行了優化，新推出的Hi-Q酶聚合反應非常快，它產生的PH值變化的峰更高、更尖、更利于判讀，這在很大程度上提高了Ion Torrent測序儀判讀Homoploymer區域時的準確性。

　　Ion Torrent相比于其他測序技術來說，不需要昂貴的物理成像等設備，因此，成本相對來說會低，體積也會比較小，同時操作也要更為簡單，速度也相當快速，除了2天文庫制作時間，整個上機測序可在2-3.5小時內完成，通量目前是10G左右，但非常適合小基因組和外顯子驗證的測序。是一種經濟、快速、簡單、規模可擴展的測序技術，非常適合擴增子測序的革命性技術。

（5）華大基因BGISEQ平臺

　　自2013年華大基因收購Complete Genomics公司后，華大基因致力于開發基因測序平臺，還喊出了“打造中國人自己的測序平臺”的口號。2014年華大推出BGISEQ-1000、BGISEQ-100兩款測序儀，這兩款測序儀主要用于基因測序診斷領域，并于2018年1月被申請注銷，測序平臺已從原有的BGISEQ-100、BGISEQ-1000升級為BGISEQ-50、BGISEQ-500。BGISEQ-500及BGISEQ-50分別于2015、2016年推出，致力于拓展生育健康類測序業務。2017年華大又推出兩款測序儀MGISEQ-200和MGISEQ-2000，這兩款測序系統充分實現了低成本購機和低成本運行，其廣泛的應用領域，包括科學研究、臨床醫學、農業、公安司法、環境工程等，實現了醫療和科研領域高通量測序系統的全面普及。

　　華大基因測序儀的與之前提到的4個測序平臺有所區別， BGISEQ/MGISEQ系列測序儀采用先進的聯合探針錨定聚合技術（cPAS）和改進的DNA納米球（DNB）核心測序技術，將DNA分子錨與熒光探針在DNA納米球上進行聚合，利用高分辨率成像系統對光信號進行采集，并通過對光信號的數字化處理，最終獲得待測DNA序列信息。具體步驟如下：

1. DNA提取與片段化

　　準備樣本 → DNA提取 → DNA片段化處理 → DNA片段末端修復

2. DNA片段擴增（納米球技術DNB）

　　加接頭序列 → 分離出單股DNA → 成環 → 滾環擴增 → 形成DNA納米球（DNB）

　　基因組DNA首先經過片段化處理，末端修復后再加上接頭序列，分離出單股DNA后并環化形成單鏈環狀DNA。環裝DNA在DNA聚合酶的作用下繞著DNA環不停地轉圈，復制出的上百份拷貝都在一股新DNA上，就像一股毛線卷成了毛線團一樣，最后形成一團DNA納米球（DNB, DNA Nano Ball），這一步即為滾環擴增技術（Rolling circle amplification, RCA），可將單鏈環狀DNA擴增2-3個數量級。

3. DNA序列識別

　　DNA納米球附著芯片 → 組合探針錨定連接法測序

　　DNB納米球經過裝載技術固定在陣列化（Patterned Array）的硅芯片上，芯片每個位點的蛋白質上自動附著上去一個DNB納米球并且不會發生堆疊。接下來就是測序過程了，華大測序儀采用了聯合探針錨定聚合(combinatorial Probe Anchor Synthesis，cPAS)技術進行測序，首先DNA分子錨和熒光探針在DNB上進行聚合，隨后高分辨率成像系統對光信號進行采集，光信號經過數字化處理后即可獲得待測序列。

4. 分析

　　堿基讀取 → 數據比對和組裝 → 基因組 → 結果分析

5. 技術優勢

　　與其他二代測序技術相比較，DNB測序技術具有以下幾個優勢：

　　 （1）DNB通過增加待測DNA的拷貝數而增強了信號強度，從而提高測序準確度；

　　 （2）不同于PCR指數擴增，滾環擴增技術的擴增錯誤不會累積；

　　 （3）DNB與芯片上活化位點的大小相同，每個位點只固定一個DNB，保證信號點之間不產生相互干擾；

　　 （4）陣列化測序芯片和DNB測序技術的結合，使得成像系統像素和測序芯片的面積得到最大化利用。