骨髓造血細胞的長期培養

小鼠

Fischer培養液 生長培養液

注射器 紗布 拭子 解剖剪 解剖鑷 培養瓶

1. 斷頸處死小鼠（ 5 只小鼠：（C57BI/6xDBA/2）F1 骨髓的長期培養效果好，但一些種系的骨髓的培養效果不佳，如 CBA [ Greenberger，1980 ]）。

2. 用 70 % 乙醇泡濕毛發，切除兩側股骨。將 10 塊股骨放人盛有 Fischer 培養液（含有 16 mmol/L（1.32 g/L）NaHCO₃，添加50 U/ml 青霉素和 50 ug/ml 鏈霉素）的 Petri 培養皿內，培養皿放在冰上。1 塊股骨含有 1.5x10⁷~2.0x10⁷ 個有核細胞。

3. 在層流超凈工作臺操作：

(a)用紗布和拭子清除剩余的肌組織。

(b)用解剖鑷固定股骨，切斷膝關節端。21G 針頭應能緊緊地插人骨髓腔。

(c)切斷股骨的另一端，盡量靠近末端。

(d)將股骨的一端插入盛有生長培養液的 100 ml 瓶內，抽出和推壓注射器活塞數次，直至將股骨內的骨髓沖洗出來。

(e)重復操作步驟 (a)~(d)，取出另外 9 塊股骨內的骨髓。

4. 用 10 ml 吸管吹打大的骨髓團塊，使骨髓分散成細胞懸液。

5. 按 10 ml 等量將細胞懸液分放入 25 cm² 培養瓶。不斷搖晃細胞懸液，以便保證將細胞均勻地分到 10 個培養瓶中。

6. 向培養瓶中充入 5 % CO₂，然后擰緊蓋。

7. 在 33℃條件下，橫置培養瓶，培養細胞。

8. 每周換液 1 次。

(a)輕輕搖晃培養瓶，使附著不牢固的細胞懸起。

(b)吸去 5 ml 含有懸浮細胞的培養液。注意吸管不要觸到附著細胞層。

(c)向每個培養瓶中加入 5 ml 生長培養液（生長培養液：分裝為 100 ml。Fischer 培養液，添加 1x10^-6 mol/L 氫化可的松和丁二酸鈉以及 20 % 馬血清。將氫化可的松和丁二酸鈉用 Fischer 培養液配制成儲存液，在 -20℃ 條件下儲藏）。不要將培養液直接加在附著細胞層上，以免損傷細胞。

(d)向培養瓶中充入氣體后，放入培養箱。

須對全部試劑進行預試驗，檢査這些試劑支持細胞生長的能力。