馬來酸酐二次衍生技術的定量蛋白質組學方法研究

基于馬來酸酐二次衍生技術的定量蛋白質組學方法研究

田姍姍¹，柏雪¹，翟貴金¹，張鍇^*,1，張玉奎²

（1天津醫學表觀遺傳學協同創新中心，天津醫科大學基礎醫學院，天津 300070

2中國科學院大連化學物理研究所，國家色譜研究分析中心，遼寧省大連市 116023）

摘要：定量蛋白質組學在當前生物醫學研究中發揮著重要作用。體外化學衍生是一種非常有效的蛋白質相對定量方法，適用于多種樣品分析。本文嘗試發展了基于馬來酸酐標記的蛋白質定量分析新方法。通過優化反應溶液、反應時間、反應物比例等實驗條件，馬來酸酐標記可以達到高效的標記效率與準確的定量結果。另外，借助于 “click”反應，可以進一步利用巰基試劑進行二次衍生。總之，本文不僅發展了基于馬來酸酐標記的蛋白質定量分析新方法，而且實現了二次可控的蛋白質和多肽衍生技術，在多樣品蛋白質組的定量分析方面具有潛力。

關鍵詞：液相色譜-質譜聯用，定量蛋白質組學，馬來酸酐標記，化學衍生，點擊化學

穩定同位素標記聯合高分辨質譜是定量蛋白質組學的主要研究手段^[1]。除體內標記外，通過體外化學衍生，引入同位素標簽是一種非常有效的蛋白質相對定量方法，適用于細胞、組織、體液等多種樣品分析^[2]。近年來，基于氨基反應的蛋白質組學定量方法得到快速發展。目前，基于氨基反應的定量蛋白質組學方法中最具代表性的是二甲基化標記^[3]、丙酰化標記^[4]和琥珀酰化標記^[5]。盡管如此，仍有一些更具潛力的標記試劑需要人們去挖掘并加以利用。

馬來酸酐不僅具有與琥珀酸酐相近的氨基反應條件，它還具有特殊的化學活性以及多種形式且廉價的同位素試劑。基于以上特點，我們認為馬來酸酐可以作為一種新型氨基標記試劑應用于定量蛋白質組學研究中。

1實驗部分：

1.1 儀器與試劑：

AutoflexⅢ TOF/TOF MS(德國Bruker公司)，超高壓液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜儀（QE，美國Thermo-fisher公司），水、甲醇和乙腈（HPLC級，美國Thermo-fisher公司），穩定同位素馬來酸酐（¹³C₄H₂O₃）和穩定同位素巰基乙醇（C₂D₄OHSH）分別購自CambridgeIsotope Laboratories公司（美國）和C/D/N ISOTOPES公司（加拿大）。

1.2 色譜質譜條件

樣品用10 uL HPLC bufferA（0.1%甲酸，體積分數，以下同）溶解，取5 uL注射到Nano-LC 系統（EASY-nLC 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）進行分離。色譜柱為C18柱（150-mm×50-um, 2 umC18, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA），多肽樣品經過高效液相色譜柱梯度分離（總時間50 min，5%~35% buffer B（0.1%甲酸；95%乙腈）40 min， 90% buffer B 10 min，流速200 nL/min）后，經過nano-ESI離子源進入Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)進行分析。電噴霧電壓設為1.8 kV，掃描方法采用data-dependent模式，一級MS掃描后進行20次MS/MS掃描，掃描范圍為m/z = 350~1750，分辨率為70,000，二級higher-energy collision dissociation (HCD) 能量為27%。MS/MS分辨率為17,500。

1.3 樣品前處理：

馬來酸酐標記：將多肽溶于200 mMNaHCO3溶液中。稱取適量馬來酸酐并用一定體積的甲醇溶解（酸酐易水解，現用現配），按照肽段:馬來酸酐 = 1:100（摩爾比）進行反應（最終反應體系中水相:有機相≈3:1）。將馬來酸酐溶液少量多次滴入到肽段溶液中，振蕩混勻，若pH<8，加2 M氫氧化鈉溶液調節溶液pH 9~10，25℃振蕩反應2 h。最后，將樣品真空濃縮抽干備用，質譜分析前需Ziptip除鹽。

巰基試劑二次標記馬來酰化肽段：將馬來酸酐標記的肽段除鹽、真空濃縮抽干后溶于甲醇中，向肽段的甲醇溶液中加入一定體積的巰基乙醇，加入三乙胺作為催化劑，室溫振蕩反應過夜（12 h）。反應完成后，將樣品真空濃縮抽干，質譜分析前需C18-Ziptip除鹽。

2. 結果與討論

2.1馬來酸酐標記的條件優化

首先，我們以合成的多肽為模型，研究了馬來酸酐對賴氨酸側鏈氨基和多肽N端氨基的衍生化反應。借助于MALDI-TOF質譜的表征和評價，優化了反應溶液、反應物比例等實驗條件。如圖1所示，有機相（DMSO和CH3OH）作為溶劑要比水相作為溶劑時標記效率高。但是DMSO沸點較高（189℃）難揮發，影響后續的質譜分析，因此我們選擇CH3OH作為馬來酸酐的溶劑。