食品衛生微生物檢驗實驗室操作要求（二）

（二）間歇滅菌方法
    1.滅菌方法系利用不加壓力的蒸氣滅菌，某些物質經高壓蒸氣滅菌容易破壞，可用此法滅菌。
    （1）將欲滅菌物品置于鍋內，蓋上頂蓋，打開排水口，使器內余水排盡。
    （2）關閉排水口，打開進氣門，根據需要消毒10～20min。
    （3）滅菌完畢關閉進氣門，取出物品待冷至室溫溫度，放入37℃溫箱過夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可達到滅菌目的。
    2．血清凝固器使用方法，培養基中含有血清或雞蛋特殊成份時，因高熱會破壞其營養成份，故用低溫，可使血清凝固，又可達到滅菌目的。
    (1) 在使用該法滅菌的血清等分裝時，需嚴格遵守無菌操作，試管、平皿也經滅菌后使用。
    (2)將培養基按要求使成斜面或高層，加足水后，接上電源，升溫75～90℃1h滅菌，放37℃溫箱過夜，再如此滅菌三次。
    3．煮沸消毒：可用煮鍋或煮沸消毒器，水沸騰后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可達到滅菌目的, 但選用煮沸消毒的增消劑時, 應注意對物品的腐蝕性.
    4．滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應仔細檢查放置,以免再度污染。
    (1) 物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用。
    (2) 取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。
    (3) 培養基或試劑等,應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態,未達到者應廢棄。
    (4) 啟閉式容器,在取出時應將篩孔關閉。
    (5) 取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。
    (6) 取出的合格滅菌物品,應存放于貯藏室或防塵柜內,嚴禁與未滅菌物品混放。
    (7) 凡屬合格物品,應標有滅菌日期及有效期限。
    (8) 每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數量、溫度、時間、操作者。

    四、有毒有菌污物處理要求
    微生物實驗所用實驗器材、培養物等未經消毒處理，一律不得帶出實驗室。
    1. 經培養的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在指定地點，待統一進行高壓滅菌。
    2. 經微生物污染的培養物，必須經121℃30min高壓滅菌。
    3. 染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經121℃30 min高壓滅菌。
    4. 涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。
    5. 打碎的培養物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。
    污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。

    五、培養基制備要求
    培養基制備的質量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養要求不完全相同，培養目的的不同，各種培養基制備要求如下：
    1．根據培養基配方的成分按量稱取，然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥品應進行質量檢驗。
    2．PH測定及調節：PH測定要在培養基冷至室溫時進行，因在熱或冷的情況下，其PH有一定差異，當測定好時，按計算量加入堿或酸混勻后，應再測試一次。培養基PH值一定要準確，否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養基的質量，指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調完PH后再加入。
    3．培養基需保持澄清，便于觀察細菌的生長情況，培養基加熱煮沸后，可用脫脂棉花或絨布過濾，以除去沉淀物，必要時可用雞蛋白澄清處理，所用瓊脂條要預先洗凈晾干后使用，避免因瓊脂含雜質而影響透明度。
    4．盛裝培養基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器為好。
    5．培養基的滅菌既要達到完全滅菌目的，又要注意不因加熱而降低其營養價值，一般121℃15min即可，如為含有不耐高熱物質的培養基如糖類、血清、明膠等，則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌，一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等，待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入。
    6．每批培養基制備好后，應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養基，使用標準菌株接種培養，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養基不應貯存過久，必要時可置4℃冰箱存放。
    7．目前各種干燥培養基較多，每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察，各種培養基用相應菌株生長試驗良好后方可應用，新購進的或存放過久的干燥培養基，在配制時也應測PH，使用時需根據產品說明書用量和方法進行。
    8．每批制備的培養基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄，以備查詢。

    六、樣品采集及處理要求
    1．所采集的檢驗樣品一定要具有代表性，采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環境衛生狀況等進行詳細調查，檢查是否有污染源存在。
    2．根據食品的種類及數量，采樣數量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。
    3．采樣應注意無菌操作，容器必須滅菌，避免環境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌，更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物，以避免殺死樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。
    4．樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1～5℃環境中，如需冷凍者，則在凍存狀態下送檢。
    5．檢驗室收到樣品后，進行登記（樣品名稱、送檢單位、數量、日期、編號等），觀察樣品的外觀，如果發現有下列情況之一者，可拒絕檢驗。
    (1) 樣品經過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者，失去代表原食品檢驗意義者。
    (2) 瓶、袋裝食品已啟開者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形狀者（食物中毒樣品除外）。
    (3) 按規定采樣數量不足者。
    對送檢符合要求的樣品，檢驗室收到后，應立即進行檢驗，如果條件不具備，應置4℃冰箱存放，及時準備創造條件，然后進行檢驗。
    6．樣品檢驗時，根據其不同性狀，進行適當處理。
    (1) 液體樣品接種時，應充分混合均勻，按量吸取進行接種。
    (2) 固體樣品，用滅菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml滅菌生理鹽水或其他溶液中，用均質器攪碎混勻后，按量吸取接種。
    (3) 瓶、袋裝食品應用滅菌操作啟開，根據性狀選擇上述方法處理后接種。

    七、樣品檢驗、記錄和報告的要求
    1．檢驗室收到樣品后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責、嚴格進行無菌操作，避免環境中微生物污染。
    2．樣品檢驗過程中所用方法、出現的現象和結果等均要用文字寫出試驗紀錄，以作為對結果分析、判定的依據，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。