1. 前言
提取蛋白質是蛋白質組學研究的第一步。植物組織的蛋白質含量較低，并且存在多種非蛋白質成分，如細胞壁及貯藏多糖、脂質和酚類化合物，使蛋白質的提取難度增大 。植物蛋白質的可溶性與它們的細胞內定位關系密切，傳統的蛋白質提取方法是用水合緩沖液、去垢劑或直接沉淀法
[1] 。除了普遍使用的 TCA/丙酮沉淀法， Hurkman 和 Tanaka 在 1986
年報道了一種先用苯酚提取然后用甲醇/乙酸銨沉淀的蛋白質提取方法，能有效去除核酸干擾，因為核酸可以與蛋白質相互作用，使雙向電泳背景深，分辨率低。
苯酚提取法首先是應用于純化碳水化合物（去除蛋白質），然后是用于純化核酸。對于分子生物學家來講，酚抽提是一種從核酸溶液中去除蛋白質的首選方法。
苯酚是最簡單的芳香醇，芳香環上帶有一個極性羥基，弱酸性，并且有腐蝕性和毒性。苯酚與水部分混溶：當達到飽和時，水相含有大約 7% 的苯酚，有機相含有大約 28% 的水。苯酚主要是通過氫鍵和蛋白質相互作用，使蛋白質變性并且溶于有機相中。因此，和一般認為的不同，蛋白質并不是留在水相和有機相的界面上，而是進入了苯酚中。
苯酚提取法主要應用于研究黏韌性植物組織或器官，如木薯 [4] 和油菜的幼苗 [ 5 ] ，馬鈴薯、蘋果和香蕉的葉片[6]，橄欖葉 [7] ，以及番茄、鱷梨和香蕉的果實 [ 8] 。
Carpentier
等、Saravanan 和 Rose 比較用
TCA/丙酮沉淀法和苯酸提取法從黏朝性組織中提取蛋白質，發現兩種方法都有效，但苯酚提取法能夠更有效地除去干擾物質，得到背景淺、垂直拖尾少的高質量凝膠。這兩種方法可減少蛋白質在樣品準備過程中由于內在蛋白質水解活動而引起的降解。同時，苯酚提取法可以得到更多糖蛋白。
苯酚提取法有高度的清潔能力。它能夠作為一種分離劑，降低蛋白質和其他分子間的相互影響。苯酚提取法最主要的不足在于它時間消耗過長（至少 6 h) ，另外苯酚和甲醇都是有毒的。
2. 材料
2.1 苯酚
飽和 Tris-HCl 緩沖液，pH 6. 6/7.9 ( Amresco- Interchim， biotechnology grade) 。
2.2 提取緩沖液
準備一份含有 500 mmol/L Tris-HCl 緩沖液、500 mmol/L EDTA、700 mmol/L 蔗糖 、100 mmol/L KCl 的溶液，并用 HCl 調 pH 至 8.0。這種溶液可以在 4°C 保存一周。
在提取之前加入 2% β-疏基乙醇和 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 ( PMSF，見注釋 1)。
2.3 沉淀液
含 0.1 mol/L 乙酸銨的冷甲醇。此溶液可以被保存在 -20°C。
2.4 等電聚焦緩沖液
9 mol/L 尿素、4% CHAPS、0.5% Triton X-100、20 mmol/L 二硫蘇糖醇 ( DTT ) 、1.2% 兩性電解質（pharmalytes)，pH 3~10 ( 見注釋 2 ) 。Triton X-100 的初始濃度為 10%。這種溶液需分裝后保存在 -20℃，可保存數月。
2.5 測定蛋白質溶液的濃度
用來自 Bio-Rad 的染色劑，根據改良的考馬斯亮藍法，測定蛋白質濃度（見注釋 3) 。
4. 注釋
( 1 ) 注意：β-巰基乙醇和 PMSF 是有毒化合物。PMSF 可制成溶于異丙醇中的 200 mmol/L 貯備液，分裝保存在 -20°C 條件下。
( 2 ) 不要加太多的水溶解 CHAPS 和尿素粉末，如 25 ml 終體積，約 10 ml 水即可。準備此溶液時，避免加熱到 30°C 以上，防止蛋白質的氨基甲酰化。溶解時間比較長。
( 3 ) 染色劑稀釋要根據 Bio-Rad 說明手冊中進行準備。
( 4 ) 得到研磨充分的粉末是非常重要的。研磨得越充分，蛋白質的提取和除去掉污染物的效果就越明顯。為了精確地進行樣品比較，粉末要研磨均勻。
( 5 ) 這一步驟特別注意保持低溫以抑制蛋白酶活性。
( 6 ) Tris 飽和苯酸要根據生產商說明來準備，并貯存在 4°C。在容器中，苯酚密度大于 Tris 溶液。一次性吸出所需體積的苯酚，以避免兩相相互混溶。
( 7 ) 這里有一個小技巧，就是在提取緩沖液中加入蔗糖，使兩相位置發生改變。
( 8 ) 在 -80°C 貯藏充分干燥的蛋白質沉淀，以延緩沉淀再次溶解的可能。恢復到室溫時，置于真空干燥器中以防止蛋白質再水化。
參考文獻
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