雖然長了些, 但耐心看完,應該對你的問題有所幫助
各位戰友 我們來聊聊PCR ：）
PCR可以說是目前分子生物學實驗中應用最為廣泛的一種技術。從最初的在幾個水浴鍋里把試管放來放去，到現在各種先進的PCR儀， 到REAL TIME PCR。 設備是越來越先進，方法是越來越多，但基本的原理還是那套。然而實際操作中，仍然有很多的問題讓人頭疼。正好看到有人建議來個PCR討論區，就信手來了這么一篇，希望能拋磚引玉 順手牽羊 大海撈針 針鋒相對 對對對 對不上來了.
PCR的原理： 別 別 別砸我，只是個標題，在這里寫PCR原理實在是浪費大家時間
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(此處略去1000字)
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增加PCR的特異性：
1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量
b. GC% 40%~~~~60%
c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性
d. 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC
e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內部形成二級結構
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結構是要加上它們
i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 較高的引物濃度(1uM-3uM)
j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。
有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃