基本方案
| 實驗方法原理 | 活體免疫染色可用于檢測改造的痘苗病毒Ankara （MVA），因為MVA不能形成分開的、易辨認的噬斑，并且這種技術不需要利用篩選的標記基因。 |
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| 實驗材料 | 匯片生長的CEF細胞 |
| 試劑、試劑盒 | 完全 MEM-2、MEM-2.5 和 MEM-10 培養基轉染細胞裂解液 干冰／乙醇 抗外源基因表達蛋白一抗 辣根過氧化物酶聯二抗 |
| 儀器、耗材 | 刀豆蛋白 A 包被的 6 孔組織培養板 杯狀超聲儀 倒置顯微鏡 無菌牙簽 細胞刮刀／1 ml注射器的活塞 75 cm2、150 cm2 組織培養瓶 |
| 實驗步驟 |
1. 胰酶消化匯片生長 CEF 細胞，將其放入刀豆蛋白 A 包被的 6 組織培養板中培養，直到細胞生長至匯片。 2. 取出轉染細胞裂解液置于冰上，在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 30 s。分別將含有 100、10、1、0.1 μl 細胞裂解液的 2 ml 完全 MEM-2.5 培養基加入每個孔中，每種濃度重復加入兩個孔中，輕輕搖晃混勻，培養 2 天。 3. 用抗外源基因表達蛋白的一抗對沒有進行固定的細胞進行免疫染色。 4. 吸出培養基，在倒置顯微鏡下觀察細胞，用無菌牙簽挑取免疫染色點，折斷牙簽，將牙簽的無菌部分分別裝入含有 0.5 ml 完全 MEM-2.5 培養基的小瓶中。 5. 反復凍融法裂解細胞懸液：用干冰/乙醇冷凍細胞，再用 37℃ 水浴及渦旋使細胞解凍。如此進行 3 次。在杯狀超聲儀上以最大功率超聲 30 s。 6. 再將其感染新的 CEF 細胞，按照步驟 2～5 進行重組 MVA 病毒的第二輪噬斑純化，再進行三輪噬斑純化。 7. 用 0.25 ml 噬斑純化重組病毒 MVA 感染在用刀豆蛋白 A 包被的 6 孔組織培養板中一個孔中培養的 CEF 或 BHK-21 細胞，加入 MEM-2.5 培養基至 2 ml。培養 2 天。 8. 吸出 1 ml 覆蓋細胞的培養基，用細胞刮刀（或 1 ml 注射器的活塞）使細胞進入剩余的 1 ml 培養基中，轉移到小瓶中。按步驟 5 反復凍融細胞獲得細胞裂解液。 9. 將 0.5 ml 細胞裂解液接種到在含有 15 ml MEM-2.5 培養基的 75 cm2 培養瓶培養的 CEF 和 BHK-21 細胞上，擴增病毒。2 天后，按步驟 8 收獲、裂解細胞。 10. 用 0.5 ml 來自步驟 9 的細胞裂解液接種在含有 30 ml MEM-2.5 培養基 150 cm2 培養瓶培養的 CEF 和 BHK-21 細胞。 11. 測定病毒滴度，制備大量的重組病毒 MVA 儲液，分成小份，-70℃ 保存。
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| 注意事項 |
1. 如果目的蛋白在細胞內表達，吸去孔中的溶液，將培養板于 -70℃ 放置 1 h。解凍并進行染色，這一步驟使細胞在原位破裂，使抗體滲透。 2. 本實驗方案中，噬斑純化用液體代替瓊脂糖作為覆蓋層，有利于免疫染色。為了檢測穩定性和純度，用另一塊培養板進行免疫染色。沒有被染色的點是由于野生病毒或不穩定的重組而引起的細胞病變導致的。 |