重組蛋白質的表達、純化、復性和定量

一、重組蛋白質的誘導表達

1.挑取轉化有質粒的單菌落，接種于 3ml 選擇性 LB 液體培養基中，37 oC，250rpm/min 振搖培養過夜。

2. 次日將培養過夜的菌液 500 μl 再接種于 10 ml（1:::20）選擇性 LB 液體培養基中，37 oC，250 rpm/min 振搖培養至光密度（OD600=0.6）時，取 1 ml 樣本作為誘導前標本，10000g 離心 1 min 收集菌體沉淀，－20 oC 凍存備用。

3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中，使 IPTG 終濃度為 1 mM，37 oC，250 rpm/min振搖培養 4～5 小時。取 1 ml 樣本作為誘導后標本，同上法收集菌體沉淀，－20 oC 凍存備用。

4. 將誘導前后菌體沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重懸，加入等體積的 2×SDS上樣緩沖液，煮沸加熱 5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，考馬斯亮藍染色 3 小時后，脫色觀察結果。

5. 選取誘導成功的細菌克隆，擴大誘導規模，收集菌體沉淀，于－20 oC 保存，準備做下一步分析及純化。

二、重組蛋白質的分離純化

重組蛋白質的可溶性鑒定

1.將按上法誘導培養后收集的菌體重懸于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中，然后在－80 oC 低溫冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解凍。

3. 在冰浴上用超聲破碎儀破菌 6 次，每次 10 sec，間歇 10 sec，電壓 200-300 V。

4. 10000g，4oC，離心 20 min，取上清（為溶液 A），－20 oC 保存；另將沉淀用同樣裂解液 1 溶解（為溶液 B），同樣－20 oC 保存，供后繼分析使用。

5. 將上述 A、B 溶液和誘導前后的細菌進行 SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍染色，比較分析重組蛋白質的溶解性。如果誘導表達的蛋白質位于 A 溶液中，則為可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，則為非可溶蛋白。

重組蛋白質為非可溶性蛋白（變性條件下）的分離純化

1.將菌體沉淀溶于適量裂解液 2（Lysis buffer under denaturing conditions ）中，室溫下攪拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 10000g，4 oC，離心 30 min，收集上清液。

3. 將 Ni-NTA Agarose 充填柱子，并連接于 Pharmarcia 低壓液相層析系統，用 5倍柱體積的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose，調節 A280 值至零線。

4.將適量上清液上樣到 Ni-NTA Agarose 柱子中，并用 lysis buffer 沖洗至 A280值低于 0.01。

5. 分別用 5～10 倍柱體積的清洗液 1 和清洗液 2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至 A280 值低于 0.01。

6. 用洗脫液（Elution buffer）洗脫重組蛋白質，在 A280 值監測下，收集出現峰線后含有重組蛋白的所有洗脫液。

三、重組蛋白質的復性、凍干和定量

純化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液緩慢透析，最終用 0.01×PBS 透析，透析后的蛋白質溶液經凍干成粉狀。以牛血清白蛋白(BSA)為標準，采用 BIO-RAD 公司蛋白質定量試劑(protein assay)比色測定蛋白質的含量。

實驗室