重組腺病毒構建，擴增及純化基本技術操作

腺病毒

PmeI酶 瓊脂糖 LB培養基 甘油 液氮 SOC 卡那霉素 PacI酶 Lipofectamine 無血清培養基 DMEM完全培養基 PBS CsCl 病毒裂解上清液 礦物油

恒溫搖床 分光光度計 恒溫水浴鍋 EP管 低溫離心機 電轉杯 電轉儀 方瓶 96孔板 37℃孵箱 –80℃低溫儲藏箱 透析袋

一、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質粒為例）

1. 選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質粒多克隆位點。

2. 重組質粒鑒定： 酶切鑒定或測序。

3. 重組質粒擴增，純化并準備適量含目的基因的穿梭質粒。

4. 用PmeI單酶切線性化重組穿梭質粒，電泳鑒定質粒完全被切開。

5. 膠回收線性化質粒，以備共轉化使用。

二、共轉化

1  大腸桿菌BJ5183電轉感受態制備

1) 從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌，接種于LB培養基中，37℃振搖過夜。

2) 接種25ml過夜培養物于500ml LB培養基，37℃振搖，至OD600 達到0.4。

3) 迅速將培養物置于冰浴中30min，至充分冷卻。

4) 將菌液轉移至預冷的離心管中，4℃下以2500r/min離心15 min，棄培養液，回收細胞。

5) 以10ml預冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。

6) 加約1ml（適量）預冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液100倍，測量OD600，至稀釋濃度為2-3×1010個細胞/ ml （1.0 OD600約2.5×10¹⁰個細胞/ml）。分裝，-80℃或液氮保存待用。

2  病毒骨架質粒轉化大腸桿菌，擴增，純化。

3  將1-5μl （約1μg） 線性化的穿梭質粒及1μl（約100ng/μl）病毒骨架質粒（如pAdEasy-1）加入至含約40μl BJ5183電轉感受態的EP管中混勻，冰上冷卻。

4  將混合物加入電轉杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。

5  電擊結束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養液，37℃低速振蕩40min。

6  取適當體積的電擊轉化細胞液涂于數個卡那霉素抗性平板（25-50mg/ml），37℃培養16-20hr。

7  次日挑取平板上長出的菌落（選擇最小的菌落），接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養基，37℃培養10-15hr。

8  堿裂法提取質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb），及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時可進行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。

9  取1-5μl 陽性質粒轉化至DH5α大腸桿菌細胞（BJ5183為recA+,質粒DNA易發生突變，DH5α或JM109，XL1-blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩定擴增已鑒定的重組質粒），擴增細菌并純化質粒。

三 重組病毒質粒轉導293細胞

1. 293細胞培養：轉導24小時前，以方瓶為例，接種2×106  293細胞于25cm2方瓶，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）

2. 以PacI單酶切重組病毒質粒（轉導25cm2方瓶約需4μgDNA），完全線性化后，乙醇沉淀，再以20 μl dd

H₂O溶解。

3. 脂質體包裹質粒（以Lipofectamine為例）：每4μg PacI約需20μl Lipofectamine包裹。質粒及脂質體分別稀釋于500μl無血清培養基再混合，置于室溫下15-30min。

4. 以無血清培養基輕輕洗滌培養瓶，另加2.5ml無血清培養基，37℃放置10min。

5. 將Lipofectamine-DNA混合物加入培養瓶，37℃孵箱放置4hr。

6. 4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養基（含10% FCS）。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養基，37℃孵育過夜，再換液。

7. 培養過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變（CPE）出現（如用pAdTrack-CMV質粒，由于含GFP，可觀察到綠色熒光）。

四 重組病毒鑒定

1. 轉導10-14d后，收集細胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心后收集上清保存于-80℃。

2. 取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞。2-3d后出現明顯細胞病變。

3. 感染后3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產生。

4. PCR鑒定重組病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，離心后取1-2μl作PCR。

五 重組病毒擴增，純化

1. 75cm2方瓶中接種293細胞，至密度達到90%，加入適量病毒上清感染細胞。3-4d后，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮，則收集所有細胞。約500g轉速離心，棄上清。

2. 以滅菌PBS重懸沉淀，反復凍融4次。4℃下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm²方瓶細胞。

3. CsCl連續梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉移至12ml超速離心管（用于SW41轉頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡后，10℃下32000 rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。

（也可CsCl不連續梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 （53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），上面小心加入6 mL CsCl 1.2 （26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9），再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm離心90min （SW28轉頭），用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）

4  病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mMMgCl2, 5% sucrose），滅菌處理。4℃透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80℃。

六 病毒滴度測定（TCID50）

1. 細胞準備：96孔板中接種100μl 293細胞，每孔細胞數約104個，以2% DMEM培養

2. 稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度（如10-3-10-10），每個濃度重復10個，每孔加入病毒稀釋液100μl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37℃下，孵箱培養10天。

3. 10d后觀察細胞，記數每排出現CPE的孔數，計算細胞病變率。（如某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0）。

4. 計算T =10×101 + d （S - 0.5） /ml

d = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋℃，d=1）

S = 各濃℃細胞病變比率之和

實驗室重組腺病毒常用質粒：病毒骨架質粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2

穿梭質粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV

也可CsCl不連續梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡后，4℃下 23000rpm離心90min (SW28轉頭)，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶。

腺病毒是一長約 36kb 雙鏈、無包膜的 DNA 病毒，具有易感染、易獲得、且能感染多種細胞等特點; 腺病毒不整合到染色體 DNA 中，因而不會帶來嚴重的副作用，可用于體內外基因治療、基因轉導等研究。