酶標抗體和酶-抗酶復合物的應用于免疫酶組化技術（APAAP法）
【基本原理】
堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯酶染色法(APAAP法)，是一種免疫組化技術。用兔抗鼠IgG起搭橋作用，其中一個Fab段連接McAb
，另一個Fab段連接APAAP復合物，再通過復合物中的堿性磷酸酶催化底物顯色來判斷抗原分子的存在。該方法由于使用免疫橋聯技術，故其敏感性高，結果易于判斷，同時又減少了內源性酶的影響，特異性強。目前已廣泛用于淋巴細胞分化抗原、活化抗原、MHC-I、II類抗原表達的檢測等。
【試劑及材料】
① APAAP試劑盒
② T緩沖液(pH7.6 0.05mol/L Tris-HCl)： Tris 30.25g，NaCl 40.0g，HCl 11ml，加蒸餾水溶解至500ml，調pH值至7.4～7.6。抗體稀釋用含1％牛血清白蛋白的T。
③ Mayer蘇木精復染液：蘇木精0.1g，鉀明礬5g，檸檬酸0.1g，水合氯醛5g，碘酸鈉0.02g，蒸餾水100ml。將蘇木精、鉀明礬和碘酸鈉溶于蒸餾水，再加溫攪拌溶解，加檸檬酸和水合氯醛，混合后煮沸5min，冷卻后過濾備用。
④ 純丙酮
⑤ McAb
【操作方法】
① 取經過預處理（固定或脫蠟）的組織切片、細胞爬片或甩片；
②純丙酮固定5min，空氣中干燥10min，T浸洗5min；取出玻片仔細擦干，用蠟筆在細胞周圍劃一圓圈；
③在圓圈內滴加第一抗體20～50μl，放濕盒內37 ℃溫育1h或4 ℃過夜。T浸洗5min，吸干；
④滴加二抗10～50μl，放濕盒內37 ℃溫育30～60min，T浸洗5min，吸干；
⑤滴加APAAP復合物10～50μl，放濕盒內37 ℃，30～60min，T浸洗5min，吸干；
⑥滴加底物顯色液10～50μl(臨用前配制，取底物溶液1ml加堅固紅1mg，充分溶崐解后使用)，放濕盒內37 ℃溫育30min，T浸洗5min，擦片；
⑦加Mayer蘇木精復染1min，用自來水沖洗。空氣中干燥；
⑧高倍鏡下觀察：以細胞膜上或胞漿著紅色為陽性細胞，無色者為陰性細胞，并計算陽性細胞百分率。
【附注】常用底物配制
1．辣根過氧化物酶（HRP）的常用底物配制
(1)H2O2/OPD：OPD 4mg溶于10ml pH5.0枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L枸櫞酸4.86ml加0.2mol/L
Na2PO4 5.14ml)中， 加入3%H2O2
50ml混勻，避光。臨用時配制。H2O2/OPD的呈色反應為棕色，比色波長為492nm。終止液為2mol/L H2SO4。
(2)H2O2/TMB（或TM）：用DMSO將TMB（或TM）配成10mg/ml原液，4℃保存。臨用前用pH5.4枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L枸櫞酸8.85ml加0.2mol/L
Na2PO4 11.15ml)稀釋成0.1mg/ml(TMB)或0.2mg/ml(TM)，每ml加入0.75%H2O2
4.2ml，此溶液應在1h內使用。H2O2/TMB（或TM）的呈色反應為藍色，比色波長為450nm。反應終止液為2mol/LH2SO4。
（3）H2O2/ABTS：ABTS 3mg溶于10ml 枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L枸櫞酸與0.2mol/L Na2PO4
等量混合)中，加入3%H2O2 10ml。H2O2/ABTS的呈色反應為綠色，比色波長為410nm。反應終止液為1.25%NaF。
（4）H2O2/DAB：DAB 4mg先溶于0.2mlDMSO或0.5ml丙酮，然后用0.01mol/L pH7.4 補至10ml，加入30%H2O2 50ml。H2O2/DAB的呈色反應為棕色，產物不可溶，常用于免疫組化染色，臨用時配制。
2．堿性磷酸酶（AP）的常用底物
對硝基磷酸鹽()： 3mg溶于5ml 10%二乙醇胺緩沖液(二乙醇胺9.7ml，MgCl2·6H2O 10mg，NaN3 20mg溶于蒸餾水，以1mol/L HCl校正為pH9.8，加水至100ml， 4℃保存。