這一部分介紹了一種原位 PCR，特別是逆轉錄酶原位 PCR 的簡略方法。詳細討論了其中的每個實驗程序。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。
| 實驗方法原理 | 原位 PCR 儀，蓋玻片，培養箱，濕盒，RT-PCR 試劑盒，Permount |
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| 實驗材料 | 組織樣品和細胞培養物 |
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| 試劑、試劑盒 | Nuclear Fast Red甲醛緩沖液檢測溶液DEPC 處理的水PBSKH2P04二甲苯乙醇牛血清白蛋白SSCNBT BCIP 顯色劑胃蛋白酶DNA 酶Taq DNA 聚合酶RNA 酶 inhibitorDNA 酶緩沖液dUTP抗地高辛的偶聯物PCR 引物 |
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| 儀器、耗材 | 原位 PCR 儀蓋玻片培養箱濕盒RT-PCR 試劑盒Permount |
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| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
Nuclear Fast Red
10%(體積分數）甲醛緩沖液 (Polyscientific)
檢測溶液（0.1mol/LTris-HCl、pH9.5，0.1mol/LNaCl)
DEPC 處理的水
磷酸鹽緩沖液（PBS)(137 mmol/LNaCl，2.7 mmolKCl,10 mmol/LNa2 HPO4)
2 mmol/LKH2P04，pH7.0, 用于細胞培養物
二甲苯（用于組織樣品）...
乙醇
牛血清白蛋白（BSA)，20 g/L
SSC，20X(3mol/LNaCl，0.3mol/L 檸檬酸鈉，pH7.0)
NBT/BCIP 顯色劑 (EnzoClinicalLabs)
2. 酶和酶緩沖液
胃蛋白酶 (2 mg/ml)(Enzo Diagnostics)
配時加 20 mg 的胃蛋白酶，9.5 mlH2O 和 0.5 ml 2mol/L HCl
無 RNA 酶的 DNA 酶（Boehringer Mannheim)
Taq DNA 聚合酶 Gold(Applied Biosystems，FosterCity,CA)
RNA 酶 inhibitor(Applied Biosystems)
DNA 酶緩沖液，10X
配時加 35ul 的乙酸鈉（3mol/L，pH3)、5ulMgS04(lmol/L) 和 60ulDEPC 處理的 H2O。
3. 核酸和寡核苷酸
地高辛標記的 dUTP(Boehringer Mannheim)，1mmol/L
4. 抗體
抗地高辛的偶聯物（antidigoxigen inconjugate)(Boehringer Mannheim)
合適的 PCR 引物
5. 專用器材
硅烷化的載破片（Ventana)
原位 PCR 儀（AppliedBiosystems)
聚丙烯薄片（polypropylenesheet)，用來作蓋玻片（有高壓消毒的袋裝市售）
設定為 37°C 和 60°C 的培養箱
濕盒（墊有浸透水的紙巾的有蓋的盒子）
6. 其他
RT-PCR 試劑盒（AppliedBiosystems)
這一試劑盒包括 RT-PCR 需要的緩沖液、核苷酸、RNA 酶抑制劑、錳溶液、rTthDNA 聚合酶以及對照引物。
石蠟包埋以及切片所需要的試劑和器材（用于組織祥品）
Permount
7. 細胞和組織
合適的組織樣品和細胞培養物
許多試劑包括蛋白酶、緩沖液、洗液、顯色劑、探針和復染劑都包含在原位雜交的試劑盒中。現在許多生物公司出售該試劑盒。
二、方法
1. 組織切片和細胞樣品的準備
（1）將材料放入 10% 的甲醛緩沖液中固定 8~15 h，然后用石蠟包埋。
（2）如果是細胞培養物，直接將 PBS 加入到培養平板中清洗一次細胞。再加入 10% 的甲醛溶液，固定過夜，然后用乳膠刮刷將細胞從平板上刮下來。將收集的細胞在 DEPC 處理的 H2O 中清洗兩次，放入臺式離心機中 2000r/min 離心 3 min。將細胞重懸于 5 mlDEPC 處理的 H20 中，取 50ul 滴加在載破片上（最佳濃度：2500~7500 個細胞），風干，室溫保存。
（3）取至少 3 份 4um 厚的石蠟組織切片或 3 份細胞懸浮液至硅烷化的載坡片上，并使材料固定在載破片上。
硅烷化處理對細胞黏附是非常必要的。
（4）將組織切片在新鮮的二甲苯中放置 5 min 除去石蠟，然后將其放入 100% 的乙醇，5 min 后取出，風干。
2. 蛋白酶處理
（5）將制好的片子放入胃蛋白酶溶液中，37°C 溫育適當時間。
確定蛋白酶孵宵的時間見表 19-1 和表 19-2. 除胃蛋白酶外，其他的蛋白酶也可用作消化處理。詳細信息參見 19.2.1.2 蛋白酶消化。
（6）將玻片放入 DEPC 處理的 H20 中 lmin, 以使蛋白酶失活，然后將其放入 100% 的乙醇中 1min, 取出，干燥。
這樣簡單的清洗步驟就足以除去/滅活胃蛋白酶，不需要加熱滅活。
3.DNA 酶處理（適用于逆轉錄酶原位 PCR)
（7）在 3 張片子的 2 張上加 lul10XDNA 酶緩沖液、lul 無 RNA 酶的 DNA 酶（10U/ul、8ulDEPC 處理的 H20。也可以選用 RT/PCR 的緩沖液代替 10XDNA 酶緩沖液。
（8）按照玻片上樣品材料的大小將聚丙烯薄片（polypropylenesheet) 裁成合適的尺寸，蓋在所加的溶液上以防止其變干。將破片放入濕盒內，37°C 溫育。
（9）消化過夜后，移去蓋片，將載坡片放入 DEPC 處理的 H20 中清洗 lmin, 然后放入100% 乙醇中，取出，干燥。
4. 反轉錄
（10）取一無菌的離心管，加入如下 RT/PCR 的試劑。
EZ 緩沖液（AppliedBiosystems) 10ul
4 種核苷酸（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP,每種核苷酸的濃度均為 10mmol/L) 各加 1.6ul
牛血清白蛋白（200 g/L) 1.6ul
DEPC 處理的 H20 15.lul
MnCl2(或者乙酸錳）溶液（10 mmol/L) 12.4ul
正義引物（20umol/L) 2.0ul
反義引物（20umol/L) 2.0ul
RNA 酶抑制劑 0.5ul
地高辛標記的 dUTP(1mmol/L) 0.6ul
rTth 2.0ul
（11）將配好的 RT/PCR 的反應溶液加在經過 DNA 酶處理的 2 張破片中的 1 張上。
（12）為了防止變干，用一小滴指甲油將聚丙烯蓋片固定在載玻片上，將載玻片放入一個鋁「船」(aluminum「boat」）內，并在其上覆蓋無菌的礦物油。然后放在熱循環儀的模塊(block) 上，于 60°C 保溫 30 min。
AppliedBiosystcms 公司的 Amplicover/Ampliclip 方法可用來替代礦物油。
5.PCR
（13）將一無菌的離心管置于冰上，加入如下 PCR 反應試劑。
Taq聚合酶緩沖液（AppliedBiosystems) 5ul
dNTP 溶液（每種核苷酸均為 10 mmol/L) 9.0ul
MgCl2,25 mmol/L 8.0ul
牛血清白蛋白，20 g/L 1.6ul
H2O 22.4ul
正義引物（20umol/L) 2.0ul
反義引物（20umol/L) 2.0ul
Taq 聚合酶 Gold(10U/ul) 2.0ul
（14）在每一個樣品上都加上 PCR 反應混合物，進行如下熱循環反應。
（15）從載玻片上除去蓋片和指甲油。在二甲苯中洗 5 min 后放入 100% 的乙醇中 5 min，取出，風干。
6. 檢測
（16）將玻片放入含 2 g/LBSA 的 0.2XSSC 中，60°C 洗 15 min(適用于逆轉錄酶原位PCR)。
對做原位雜交 PCR 而言，如果使用至少 80bp 大小的全長基因組探針，就用上述洗液清洗。如采使用小于 45bp 的寡探針雜交，則用含 20 g/LBSA 的 1XSSC 在 45°C 洗 10min。
（17）除去殘余的洗液，每張載玻片加 100ul 含地高辛抗體（按 1:150 稀釋）的 0.lmol/L Tris-HCl，pH7,5，0.1mol/LNaCl 溶液。37°C 溫育 30 min。
（18）用檢測溶液洗玻片 lmin，然后將其轉入含有 NBT/BCIP 顯色劑的檢測溶液中，37°C溫育 5~30 min, 在經銷商的使用說明中有詳細說明（EnzoClinicalLabs)。如果是直接將標記物摻入到擴增 DNA 中，則溫育時間可短些；如果是使用探針檢測，則溫育時間要求長一些。將載玻片放在顯微鏡下鏡檢，當見到強烈的信號時終止反應。對原位雜交 PCR 而言，探針-擴增子復合物應當雜交 15 h; 針對此目的推薦使用地高辛標記的探針。同時，在允許的情況下盡可能地使用最長的探針（最好 80~100bp), 這很重要。由于引物的低聚反應一般不會在原位雜交 PCR 中發生，因此可以使用包含引物區段的全長探針。同樣，使用隨機延伸的方法標記探針也很重要（Nuovo1997)。如果使用較短的探針，它們不得短于 45bp, 并且要采用 3'末端的方法標記(Nuovo1997)。
（19）將載玻片在水中清洗 1 min，用 nuclearfastred 復染 5 min，再在水中清洗 1 min，然后放入 100% 乙醇中 lmin，二甲苯中 lmin。用 Permount 封片，顯微鏡下觀察。 |
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