組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA.再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達.RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能.該技術主要用于:分析基因的轉錄產物,獲取目的基因,合成cDNA探針,構建RNA高效轉錄系統.
Trizol法RNA提取步驟
標記EP管，分3組
第一組EP管加入氯仿0.2ml，二組加入異丙醇0.5ml，三組加入75%乙醇1ml
1ml Trizol、心或肺50～100mg、液氮依次加入到研缽中，研碎
收集組織液1.5ml至EP管，離心：15000rmp、4℃、15min
取上清，轉移至氯仿組，搖晃15s，冰上放置10min
離心：15000rmp、4℃、15min
取上清，轉移到異丙醇組的EP中，冰上放置20min
離心：15000rmp、4℃、15min
棄上清，加75%乙醇1ml（0.1%DEPC水配制）
離心：15000rmp、4℃、5min
棄上清，干燥15min，加100ul DEPC處理的水