逆轉錄元件發生反向剪接插入DNA過程的原理與結構基礎

　　逆轉錄元件是一種以RNA為媒介，通過“copyand paste”的方式在基因組中不斷擴增的基因元件【1,2】。在哺乳動物基因組中有超過45%的遺傳成分都是逆轉錄元件，因此逆轉錄轉座事件如果在不恰當的地方發生就會導致基因紊亂或者基因疾病等嚴重后果【3】。

　　II組內含子（Group II introns）作為其中一類逆轉錄元件，剪接體和長散布核元件（Long interspersednuclear elements, LINE）都曾被認為是起源于它【4】。而II組內含子要發揮它逆轉錄元件的功能，首先就必須經歷正向剪接反應——成熟酶在結合內含子并幫助它從pre-mRNA上切除之余，還通過2’-5’磷酸二酯鍵將兩個外顯子連接。與此同時，套索結構的內含子同成熟酶形成了一個逆轉錄元件復合物參與到逆轉錄轉座事件中。其中，成熟酶是如何在剪接過程中發揮積極作用以及催化活性中心剪接位點是如何發生交換的機制都尚未可知。

圖1. 正向剪接與反向剪接原理示意圖

　　近日，加州大學圣地亞哥分校（University of California, San Diego）的Navtej Toor課題組在Cell上在線發表了題為Cryo-EM Structure of a Group II Intron Reverse Splicing into DNA的研究成果。作者通過解析藍細菌II組內含子反向剪接過程中兩種不同階段的冷凍電鏡結構（分辨率均為3.6?），闡明了II組內含子反向剪接進DNA的結構機理以及剪接過程中位點發生交換的結構基礎，同時也揭示了成熟酶在該過程中的功能貢獻。

　　基于兩種不同反應階段的電鏡結構（圖2.A，圖2.B），作者詳細解釋了反向剪接的原理與過程，如圖2.C所示。II組內含子與成熟酶形成復合物先和目標DNA結合并形成部分配對的復合體，之后的第一階段是DVI和DII結構域通過π-π’和η-η’作用相互靠近并將3’端羥基指向活性位點處，有助于酯基交換反應的發生，使得RNA的3’端與DNA的5’端共價連接；反應之后DVI結構域旋轉了90度從而與成熟酶thumb-X結構域相互結合，這一構象變化將套索結構的2’-5’磷酸二酯鍵放置在了催化中心，此時DNA的3’端羥基對其發起第二輪親核進攻，發生酯基交換反應之后形成共價連接，最終實現了將II組內含子整合進基因組中。

圖2. A. II組內含子反向剪接時的Pre-1r階段電鏡結構圖； B. II組內含子反向剪接時的Pre-2r階段電鏡結構圖； C. DNA整合與活性位點底物交換模型

　　其中，作者發現成熟酶在此過程中發揮了積極促進的作用并將關鍵位點鎖定在thumb-X結構域與DVI結構域的交界面上。因此作者設計了一系列不影響正向剪接反應的成熟酶突變體，結果證明thumb-X結構域與DVI結構域的相互作用不管是對于正向剪接時發生的親核進攻反應還是對于反向剪接時將套索結構交換至活性位點都十分必要。

圖3. thumb-X結構域與DVI結構域的交界面以及關鍵殘基

　　總之，該工作通過對比反向剪接過程中兩種不同狀態的冷凍電鏡結構，細致地解釋了逆轉錄元件發生反向剪接插入DNA過程的原理與結構基礎，也首次突出了成熟酶在過程中發揮的重要作用。此外，II組內含子VI結構域的動態變化更是與剪接小體中發生的動態變化相似，為剪接小體的來源奠定了強有力的理論基礎。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.06.035

　　參考文獻

　　[1] Zimmerly, S., Guo, H., Eskes,R., Yang, J., Perlman, P.S., and Lambowitz, A.M. (1995a). A group II intron RNAis a catalytic component of a DNA endonuclease involved in intron mobility.Cell 83, 529–538.

　　[2] Zimmerly, S., Guo, H., Perlman,P.S., and Lambowitz, A.M. (1995b). Group II intron mobility occurs by targetDNA-primed reverse transcription. Cell 82, 545–554.

　　[3] Deininger, P.L., and Batzer,M.A. (2002). Mammalian retroelements. Genome Res. 12, 1455–1465.

　　[4] Eickbush, T.H. (1999). Mobileintrons: retrohoming by complete reverse splicing. Curr. Biol. 9, R11–R14.