根據酶催化反應最適條件的要求，原則上在酶測定體系中應加入一定量的輔助因子。輔助因子（cofactors）是指酶的活性所需要的一種非蛋白質成分，包括輔酶、輔基和金屬離子激活劑。與酶緊密結合的輔因子稱為輔基；不含輔基的酶蛋白稱為脫輔基酶蛋白（apoenzyme），沒有催化活性，必須加入足量輔基，和它結合成為全酶（holoenzyme），才有催化活性。脫輔基酶蛋白與輔基孵育一段時間后，酶活性才會恢復，因此，往往需要樣品與試劑中的輔基先預孵育的過程。輔基的用量往往較少。
與酶蛋白結合很松弛，用透析和其它方法很易將它們與酶分開的稱為輔酶（Coenzyme）。輔酶盡管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物類似，在酶反應過程中與酶結合、分離及反復循環。輔酶用量的確定可將它們按底物處理。例如乳酸脫氫酶中輔酶按雙底物動力學方程計算。
激活劑（activator）的化學本質是金屬離子，可以是酶的活性中心，也可以通過其他機制激活酶的活性。作為激活劑的金屬離子，其影響酶促反應的動力學更加復雜。最常見的是二價金屬離子如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+等。重金屬離子大多是酶的變性劑。金屬離子之間往往存在相互拮抗或相互抑制。在酶測定體系中經常加入EDTA目的是螯合一部分非必要的離子。合適的金屬離子濃度是必要的，過量的離子往往抑制酶反應速度。由于激活劑的動力學往往與酶的動力學不同，這就可以解釋不同的樣品與反應液的比例，造成酶活性測定結果的不呈比例。N-乙酰半胱氨酸對肌酸激酶的激活作用與此類似。激活劑的用量一般通過反復實驗來確定。