駐留體積及其對分離的影響是困擾色譜分析人員的一大難題。通常在駐留體積不等的儀器上使用同尺寸的色譜柱會有一系列問題，另外，將方法在各個實驗室之間轉換時，即便使用同一臺儀器，要更改色譜柱尺寸和體積，駐留體積仍然是個問題。本文介紹了采用ISET技術應對這一系列挑戰的解決方案。
駐留體積的定義
駐留體積是指溶劑首次混合點（通常在液相色譜儀的混合腔內或比例閥中）與液相色譜柱頭之間的體積。其中，低壓混合系統的駐留體積等于從比例閥經泵和其他系統組件到柱頭的體積總和（見圖1）。高壓混合系統的駐留體積等于從溶劑首次混合點，經過兩個計量泵再到柱頭的體積總和（見圖2）。
在等度分離中，駐留體積對保留時間沒有任何影響，而在梯度分離中則會造成重大影響。若不了解系統的駐留體積，可能會帶來嚴重影響，因為駐留體積有可能遠大于色譜柱體積。
相同色譜柱，不同儀器
若想在不同儀器上使用相同尺寸的色譜柱，往往需要考慮駐留體積這個問題，因為不同駐留體積的儀器使用同一方法也可能影響分析結果。在柱頭開始梯度洗脫時，需要確保通過色譜柱的流動相體積相同。如果流動相的體積不相同，結果也將不同（見圖3）。
若在兩個實驗室內對不同駐留體積的 HPLC 儀器使用相同的方法，運行結果很可能不完全相同，因為兩種（或多種）流動相混合形成梯度后，將在各個儀器的流路內經過一段不同的時間后方能到達柱頭。因此，進樣后受時間影響，分析物將通過不同的流動相組分，其保留時間和分離度也會受到影響。如果將梯度方法從一臺儀器轉移到另一臺儀器，保留時間會根據兩個系統的駐留體積發生變化。流路體積越接近，結果的一致性越高。
結果如有差異，可采用多種方法加以糾正。若儀器的駐留體積較小，可以通過增加儀器的體積來調節駐留體積；若儀器的駐留體積較大，可以減小儀器連接管線的內徑和長度。此外，還可以在該方法中設置梯度延遲，以補償流路系統中的不同駐留時間。
安捷倫1290 Infinity系統采用智能化系統模擬技術（ISET），可以輕松解決上述問題。ISET在1290 Infinity 液相色譜儀上模擬安捷倫或其他液相色譜系統的不同延遲體積和混合行為，無需手動更改方法或硬件，即可提供與原儀器或原方法相同的分析結果（注：某些認證方法可能不允許分析中使用這種改變）。
相同儀器，不同尺寸的色譜柱
更改單個儀器上的色譜柱直徑和色譜柱體積前，應當考慮其對分離的影響。為了確保實驗條件相同，更改色譜柱內徑時需要對色譜柱體積的差量作出補償。
假設儀器的駐留體積為1 ml，若 2.1×100 mm 色譜柱的體積為0.2 ml，流速為0.2 ml/min，那么柱頭開始梯度洗脫需要5 min（即5個色譜柱體積）。這實際上就是梯度開始前色譜柱經歷的等度保持。若換用更大體積的色譜柱，例如體積約為 1 ml 的 4.6×100 mm 色譜柱，流速為 1 ml/min，則駐留體積可能僅約為1個色譜柱體積。
要在 4.6 mm 的色譜柱上模擬與更小色譜柱的相同條件，則需要增加一個等度保持。采用該方法，只需根據色譜柱內徑的變化對梯度條件作出相應的調整，在柱頭開始梯度洗脫前，4.6 mm 的色譜柱將具有等量的柱體積。
小結
駐留體積及其對分離的影響，是色譜分析人員在日常工作中經常面臨的問題，尤其在梯度分離中，可能帶來嚴重的影響。采用智能化系統模擬技術（ISET）的安捷倫1290 Infinity 系統，能幫助分析人員輕松解決上述因駐留體積及其對分離影響帶來的難題。