根據檢驗技術所依據的原理,可以將目前的技術大致分為以下幾種。
1、依賴于GMO中DNA成分的PCR技術
PCR 是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)的簡稱。它模擬 DNA 聚合酶在生物體內的催化作用,在體外進行特異 DNA 序列的聚合及擴增。PCR 簡便、快速,可以在一只小小的離心管中,短短的幾小時內使某特異 DNA 片段擴增數萬倍,所需的 DNA 模板量僅為10ng 以內,而且使用粗提的 DNA 就可以獲得良好的擴增效果,因而這一技術的出現為外源基因整合的檢測提供了便利的條件,尤其是在轉化材料少又需要及早檢測的情況下。但是,由于 PCR 擴增的高度靈敏性,有時會出現假陽性擴增,因此,常常使 PCR 與其他技術結合,目前常用的 PCR 種類有:普通 PCR、槽式 PCR、多引物 PCR、定量 PCR、PCR-ELISA 等。
PCR 反應具有高度特異性和敏感性,只需對少量的 DNA 進行測定便可檢測 GMO 成分,但對實驗技術的要求很高,其結果易受許多因素的干擾而產生誤差,如操作人員移液時的誤差、器皿用品的交叉污染等等,還有 PCR 反應體系存在的抑制因素也可帶來干擾,一般PCR 只用作轉基因食品的定性篩選檢測。
針對所存在的問題,研究人員在實驗設計中引入內部參照反應,以消除檢測時的干擾,并與已知含量的系列 GMO 標準樣的 PCR 結果進行比較,從而可以半定量地檢測待測樣品的GMO 含量。建立內部參照反應體系利用高純度的 pBI 121質粒(含兩個35S 啟動子),以相同的引物對其 DNA 擴增可產生兩條帶,一為與常規35S啟動子一致的195bp 帶,另一為500bp 帶,是 DNA 鏈上兩個35S 啟動子之間的序列擴增的產物。將此質粒 DNA 與待測樣品 DNA 以同一對引物共擴增,分析擴增結果,有助于減少實驗中的誤差,得到可靠的半定量結果。但是,雖然半定量競爭 PCR 法在實驗中對 PCR 模板量有所確定,在PCR 反應中引入質粒的雙35S 啟動子 DNA 進行共擴增,以幫助消除反應中未知因素帶來的假陰性現象,但是其實驗原理與常規的定性 PCR 篩選原理基本相同,對 GMO 含量的確定是與參考標準樣的比較而定,檢測結果的準確程度取決于實驗者,不同實驗室或重復實驗的結果都可能會有差別,因而此方法仍未達到定量檢測 GMO 含量的要求,僅作為半定量方法使用。此方法操作較為方便,但準確性較低。
PCR-ELISA-也是一種半定量檢測方法,其基本原理是:利用共價交聯在 PCR 管壁上的寡核苷酸作為固相引物,在 Taq 酶作用下,以目標核酸為模板進行擴增,產物一部分交聯在管壁上,為固相產物,一部分游離于液體中,為液相產物。對于固相產物,可用標記探針與之雜交,再用堿性磷酸酯酶標記的鏈親和素進行 ELISA 檢測,同時可通過凝膠電泳對液相產物進行分析。PCR-ELISA 法將 PCR 擴增的高效性和 ELISA 的高特異性結合在一起,靈敏度高達0.1%,足以達到歐盟的要求(轉基因檢測閾值為1%);而且結果的判定通過紫外分光光度計或酶標儀,以數字的形式輸出。與此同時,通過凝膠電泳對液相產物進行檢測。兩次檢測有效地避免了假陽性出現,提高了檢測結果的可靠性。
在此基礎上,科學家發展了定量競爭 PCR 檢測技術:先構建含有修飾過的內部標準 DNA片斷(競爭 DNA),與待測 DNA 進行共擴增,因競爭 DNA 片斷和待測 DNA 的大小不同,經瓊脂糖凝膠可將兩者分開,并可進行定量分析。取定量模板 DNA,所含 GMO 量分別為0～100%的系列參考樣,分別與一定量的競爭 DNA 在同一反應體系進行PCR擴增。特異轉基因 DNA 與競爭 DNA 競爭反應體系中的相同底物、引物,PCR 反應獲得相差數十個堿基的兩條凝膠電泳帶,兩條帶濃度隨轉基因成分含量的不同而有差異。當兩條帶濃度相等,則說明此參考樣 GMO 濃度與競爭 DNA 濃度相等。定量競爭 PCR 法的實驗原理比較巧妙,實驗程序設計較為嚴謹,采用構建的競爭 DNA 與樣品 DNA 在同一體系中相互競爭相同底物和引物,并根據電泳結果做工作曲線圖,從而得到可靠的定量分析結果。1998年歐盟的12個實驗室共同對競爭 PCR 法進行了研究,結果表明競爭 PCR 法與定性PCR 法相比大大降低了實驗空間的實驗誤差,競爭 PCR 法完全可以對轉基因食品的 GMO 含量進行檢測,包括有關法規確定的 GMO 含量的下限量。此方法對實驗儀器要求不高,不足之處是需要用基因重組技術構建標準競爭 DNA,對一般實驗室來說難度較大。
實時定量 PCR 法(real-time quantity)采用了與此不同的思路,即設計一個內部探針,該探針包含5′端熒光報告因子和3′端猝滅因子。PCR 反應前,由于猝滅因子與熒光報告因子的位置相近,使熒光受到抑制而檢測不到熒光信號。隨著 PCR 反應從上游的 PCR 引物開始,引物和標記探針與目標 DNA 分子中對應的互補序列復性,聚合酶與探針相遇,利用其5核酸外切酶活性使報告因子釋放,產生的熒光可被內設的激光器記錄,記錄到的熒光強度可反映PCR的產物量,從而實現實時定量分析。實時定量法的靈敏度至少是競爭 PCR的10倍,可檢測到每克樣品中2pg 轉基因的 DNA 量。該實驗操作自動化,檢測信號具有特異性,對未加工、加工和混合的樣品都可檢測。已有實驗室用實時定量法作 GMO 定量篩選的檢測方法,但對方法的標準化研究仍有待加強。缺點是需要購買價格昂貴的專門儀器,較難推廣。
2、免疫學方法
免疫學方法主要是利用抗體可以特異地與抗原分子(GMO 蛋白成分)結合,因此通過抗原抗體的特異性識別反應來進行檢測,是一種特異而簡便的檢測程序。目前,人們發明了許多種不同的方法來檢測抗體與其目標抗原的結合,酶聯免疫吸附測定(ELISA)就是其中的一種方法。在酶聯免疫測定的過程中,抗體上通常還連接有一種酶,如堿性磷酸酶、過氧化物酶或脲酶等,這些酶都能夠催化一種化學反應將無色底物轉化為有色物質。如果樣品中帶有目標分子,抗體上連帶的酶就能夠將無色的底物轉變成有色物質,通過顏色的變化就能判斷出被測樣品中是否含有目標分子。目前,美國 SDI 公司已獲得孟山都公司導入基因和蛋白使用權,開發出利用免疫技術的試劑盒“Trait 大豆 bulktest”和“GMO 大豆試劑盒”。
3、核酸雜交技術
核酸雜交技術的基本原理是兩條 DNA 鏈之間可以通過堿基配對而形成氫鍵,通常核酸雜交的檢測過程主要包括以下幾個步驟:將單鏈的目的 DNA 結合到膜上,然后加入單鏈、標記過的探針 DNA,在一定的溫度條件和離子濃度下使探針分子與目標 DNA 分子堿基配對,再洗去未結合的標記探針,檢測探針和目標 DNA 形成的雜合分子。由此可以看出,一個核酸雜交檢測有三個關鍵因素:探針 DNA、目的 DNA 和信號檢測。把握好這三個因素,核酸雜交技術可以達到高特異性和高靈敏度的水平。
4、生物傳感器和生物芯片技術
隨著轉基因產品種類的不斷增加,過去所建立的轉基因檢測方法將難于適應未來的發展需要,因為這些方法均是一次對單個或少數幾個基因的檢測,而近年的熱點—基因芯片檢測方法將極可能成為未來對轉基因成分檢測的發展方向。基因芯片,又稱 DNA 芯片或 DNA陣列,它與我們日常所說的計算機芯片非常相似,是成千上萬的網格狀密集排列的基因探針。它通過已知堿基順序的 DNA 片段,來結合堿基互補序列的單鏈 DNA,從而確定相應的序列。通過基因芯片可以一次對數萬種轉基因成分進行檢測。盡管該方法目前還存在靈敏度偏低、穩定性差、價格昂貴、離實際應用還有一段距離等缺點,但在不遠的將來將取得突破性的進展。
如同所有的新技術那樣,轉基因技術也如同一把“雙刃劍”,既有利也有弊,它對于食品安全分析有著極其重要的意義。