(2)受體母鼠的準備
輸卵管轉移的受體鼠應該為4-6周齡大小,體重在20-25克左右,嚴禁用低體重以及超重母鼠,若體重較低,其體能不足以維持妊娠,可能導致受精卵的重新吸收;若體重較重,麻醉劑被吸收入脂肪組織,降低麻醉效果,可能使手術困難,而且脂肪組織的存在意味著靜脈的存在,所以手術時切掉脂肪組織可能導致不必要的出血,難以確認手術時的操作對象。出血也可能堵塞移卵管。選擇輸卵管轉移前一天晚上與切除輸精管小鼠交配的假孕母鼠,注射當天早上母鼠可見精栓。盡管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重,隨著體重的增加,它們將表現出不同程度的感覺消失,但它們是優良的哺育母鼠。另外,它們的價格也便宜。另一個成功的鼠系是B6D2F1,它們生命力強并有一定雜合優勢。
(3)麻醉劑:阿佛丁被證明是輸卵管轉移手術的有效麻醉劑。
(三)實驗操作程序和方法
1.鼠系克隆
(1) 動情期的探測:在轉基因動物模型的建立中母鼠動情期的監測有很高的技巧性。小鼠的動情期主要劃分為四個時期:
① 動情后期:陰道口無擴張,周圍組織為灰白色,陰道口周圍無膨大
② 間情期:陰道開口小,周圍組織為灰色或藍色。
③ 動情前期:陰道口逐漸擴張,陰道周圍組織由粉紅色變為紅色。
④ 動情期:陰道周圍組織顏色由紅色轉為粉紅色,陰道口背側唇可見條
紋,陰道口腹側唇可見腫大,陰道有分泌液外滲。
隨機選擇動物,任何時間都可能有20%-25%的動物處于動情期。大多鼠科動物的動情期平均持續4-5天,所以對群居性動物的個體進行動情周期的同步化處理后可能在任一時期產生大量發情動物。動情期動物的選擇需兩個指標:陰道周圍組織色澤和組織膨脹的程度。動情期動物陰道組織深粉紅色,但并不同于炎癥時的色澤。另外,陰道口周圍背腹部組織腫脹而有光澤,起初其腹部可見條紋。個別陰道口組織色澤較深,但無膨脹,或陰道口稍微擴大且略帶灰色者為非動情期動物,切勿誤選它們用于交配。
(2)交配的確認:陰栓形成。動物合籠后,確定雄性個體是否與母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在陰道內凝固成柔軟栓性物,成功交配后不久有陰道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根處,使小鼠頭部向下,仔細觀察陰道口部位,交配過的雌性小鼠可見有白色橡皮擦狀的陰道栓,易肉眼所見,難以確定時可用小探針檢查陰道深部是否有栓子存在。檢查陰栓應在每天早上的早些時間,因為隨著時間的推移,陰栓將被排出體外。
2.輸精管切除術:輸精管切除小鼠用于與晶胚轉移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周齡進行輸精管切除術,CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的實驗對象。阿佛丁腹腔注射麻醉劑量為240mg/kg。
(1) 稱重后麻醉小鼠,背位固定小鼠,大剪刀貼近皮膚剪毛,70%的乙醇涂 搽消毒手術切口部位,以防止毛發污染切口。
(2) 于生殖器前方大約1.3cm處橫行剪開下腹部皮膚,作約1cm的切口,
用浸70%乙醇的紗布搽拭切口部位以清理毛發。
(3) 切開腹膜,進行膀胱定位。每側都可見有一條管道走行,用鑷子輕輕夾
持左側管道,提起部分使手術視野清晰可見,確定其為輸精管。
(4) 將鑷子插進輸精管下方,使它們處于自然狀態,其末端垂直。同時在該
位置兩端用縫線結扎輸精管,距離大約4-5毫米。在兩結扎點間剪斷輸精管,置其于紗布上確定此側手術完畢。
(5) 將輸精管兩個斷端輕輕放回腹腔,如上處理右側輸精管。兩側手術完畢后,2-3根單獨縫線縫合腹壁切口。待用縫線須浸泡在70%乙醇中,保持縫線濕潤,防止結扎時粘附組織。用兩個或三個自動小夾夾閉皮膚。