超越mRNA疫苗？北大開發可應對新冠突變株的環狀RNA疫苗

　　2020年初，新冠病毒（SARS-CoV-2）導致的肺炎疫情開始在全球大流行，并一直延續至今。遺憾的是，直到今天，新冠疫情的形勢仍然非常嚴峻。據世界衛生組織（WHO）報告，截至目前全世界范圍內超過1.8億人被感染，累計死亡人數接近400萬。

　　值得注意的是，隨著新冠病毒在全球范圍內的廣泛傳播，新的變種病毒不斷涌現，包括在英國首先發現的B.1.1.7（現在名為Alpha），首先在南非出現的B.1.351（現在名為Beta），首先在南非出現的P.1（現在名為Gamma），以及首先在印度出現的B.1.617（現在名為Delta），這些變種病毒往往具有多重變異，并表現出更強的傳染性和逃逸免疫能力。

　　2021年4月23日，印度醫學研究理事會（ICMR）的一項研究表明，Delta突變株在S蛋白上具有L452R和E484Q雙重突變，并表現出抗體中和反應的下降。

　　這些研究提醒了我們，在新冠病毒不斷變異的大背景下，現有疫苗和治療性抗體或將逐漸降低效果。因此，迫切需要開發安全有效的預防新冠病毒及其突變株感染的疫苗。

　　近日，北京大學魏文勝團隊在預印本平臺 bioRxiv 上發表題為：Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants（抗SARS-CoV-2和新變種的環狀RNA疫苗）的研究論文。

　　該研究報告了一種編碼新冠病毒刺突蛋白三聚體受體結合域（RBD）的環狀RNA疫苗（circRNA-RBD），circRNA-RBD疫苗可以通過體外轉錄快速生成，且不需要核苷酸修飾，具有高度穩定性。

　　研究團隊通過脂質納米顆粒（LNP）封裝的circRNA-RBD疫苗成功誘導了強有力的持續中和抗體，且該疫苗具有很強的熱穩定性，室溫下儲存2周時間，依然不影響表達。

　　更重要的是，研究團隊利用編碼RBD變體（K417N-E484K-501Y）的環狀RNA疫苗成功在小鼠體內誘導產生有效中和Beta變異株的抗體，表明環狀RNA疫苗在抗擊新冠變種病毒上具有十分良好的應用前景。

　　21世紀以來，冠狀病毒共引起了三次人畜共患疾病，例如2002-2003年的SARS-CoV，2012年的MERS-CoV以及2019年底爆發的SARS-CoV-2。已有的研究表明，冠狀病毒通過表面的刺突蛋白（S蛋白）與宿主細胞表面的受體蛋白ACE2結合，從而介導膜融合和病毒入侵。

　　S蛋白含有兩個亞基——S1和S2，其中S1亞單位C端的受體結合域（RBD）介導新冠病毒入侵宿主細胞，S2亞單位則介導病毒與宿主細胞膜的融合。新冠病毒的S蛋白、S1亞基或RBD抗原均可以誘導B細胞和T細胞反應，產生抗新冠病毒的高效中和抗體。

　　接種疫苗是結束和預防新冠大流行最有希望的方法。目前已應用的新冠疫苗種類眾多，包括滅活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、病毒載體疫苗以及新興的mRNA疫苗。

　　新興的mRNA疫苗，具有生產速度快、成本低，并且能快速應對病毒變異等優點。但與此同時，mRNA疫苗儲存和運輸條件較為苛刻（－70℃），并具有潛在的免疫原性副作用。

　　在自然界中，環狀RNA（circRNA）普遍存在于真菌、植物、昆蟲、魚類和哺乳動物，甚至于某些病毒的基因組本身就是環狀RNA，如D型肝炎病毒和植物類病毒。與線性mRNA不同，環狀RNA是高度穩定的，因為它的共價閉合環結構可以保護它免受外切酶介導的降解。

　　到目前為止，只有少數內源性的環狀RNA被證明可以作為蛋白質翻譯模板。雖然環狀RNA缺乏翻譯成蛋白質所必要的元件，但它可以通過內部核糖體進入位點（IRES）或其5'UTR區域的m6A修飾來實現蛋白質翻譯。

　　在這項研究中，研究團隊針對新冠病毒及其變種病毒設計了環狀RNA疫苗。研究人員利用自我剪接Ⅰ型內含子核酶來產生編碼SARS-CoV-2-RBD抗原的環狀RNA——circRNA-RBD。為了增強RBD抗原的免疫原性，研究人員將噬菌體T4纖溶蛋白三聚體基序融合到其C端，以此模擬了新冠S蛋白三聚體的自然構象。

circRNA-RBD的設計模式圖

　　緊接著，研究團隊將純化后的circRNA-RBD轉染到HEK293T細胞中，通過Western blot檢測上清液中大量產生新冠病毒的RBD抗原。ELISA定量檢測顯示RBD蛋白在上清液中達到約143ng/mL，是線性RNA-RBD對照組的50倍。此外，研究人員還進一步證實了circRNA-RBD可以在小鼠NIH3T3細胞中表達。

　　這些結果表明，circRNA-RBD可以在人和小鼠細胞中大量表達新冠病毒的RBD抗原。

相較于線性RNA-RBD，circRNA-RBD的表達量更高

　　不僅如此，研究人員還使用hACE2過表達HEK293細胞和攜帶EGFP綠色熒光報告基因的新冠假病毒進行結合競爭實驗，以驗證由circRNA-RBD產生的RBD抗原是否具有功能。他們發現，分泌的SARS-CoV-2 RBD抗原能有效阻斷新冠假病毒感染。

circRNA-RBD產生的RBD抗原可以有效阻斷新冠假病毒感染

　　在動物實驗上，研究團隊將脂質納米顆粒（LNP）包裝的circRNA-RBD注射到小鼠體內。研究結果顯示，接種了circRNA-RBD疫苗的小鼠的血清可以中和新冠假病毒，且小鼠脾臟中產生了強烈的T細胞免疫應答。

　　這些現象表明，circRNA-RBD疫苗確實在小鼠體內誘導了持久的體液免疫應答和強烈的T細胞免疫應答。

circRNARBD疫苗在小鼠體內誘導了持久的體液免疫應答和強烈的T細胞免疫應答

　　研究團隊還設計了針對Beta突變株的circRNA-RBD疫苗——circRNA-RBD-501Y.V2，circRNA-RBD-501Y.V2和circRNA-RBD疫苗，Alpha、Beta和Gamma突變株均有效，其中circRNA-RBD-501Y.V2疫苗對Beta突變株具有更高的中和活性。（該研究進行時，Delta突變株尚未出現）。

　　此外，作者還表示，circRNA還可以用于表達一些其他蛋白質或肽，從而應用于一些罕見疾病或癌癥的治療。

針對突變株的環狀RNA疫苗——circRNA-RBD-501Y.V2

　　總而言之，這項研究證實，circRNA疫苗具有熱穩定性好、編碼抗原表達量高以及適用性廣泛等優點，并成功設計了相應的circRNA疫苗來對抗新冠病毒及其突變株的感染，表明circRNA疫苗在COVID-19大流行中可以作為一種全新的疫苗和治療平臺。