提取方法
將堆肥樣品(0.5g)放入離心管中，加入已知濃度的標準雌激素混合物;然后用高速渦旋勻漿(1min)，在4℃下保持12 h，以保證藥物的吸附。同時制備了非加標堆肥的對照樣品。
將體積為5ml的甲醇加入到加標的堆肥樣品中;然后，渦旋1分鐘，超聲15分鐘，在4000轉/分、4℃下離心5分鐘。然后倒出上料，用溫和的氮氣流蒸發至40C干燥，用1ml甲醇(10%)重組。接下來，固相萃取(SPE)，用 HLB 60 mg-6 ml Supelco進行凈化。首先，用3ml甲醇和5ml超純水對墨盒進行調節，然后，對提取液(1ml)進行過濾，丟棄濾液。墨盒在真空條件下(<2 kPa)干燥1分鐘，然后用6mL甲醇(10%)洗滌。在真空條件下(>2 kPa)再次干燥1分鐘，用6ml甲醇(10%)洗脫。接下來，用溫和的氮氣流濃縮洗液，直到在40℃下干燥，用500uL乙腈(ACN)重組。然后用0.2 um PTFE Whatman過濾器過濾，將提取液轉移到1mL小瓶中進行 UHPLC-MS/MS分析。
提取效率，即平均回收率，是通過對10個堆肥樣品的萃取物進行分析確定的，這些堆肥樣品加入了已知雌激素濃度的標準混合物，低(6.0ng-g)、中(60.0 ng-g)和高(堆肥:180ng-g)。平均回收率的變異系數必須小于15%。
超高壓液相色譜和質譜法
用UHPLC-MS/MS對重組提取物中的雌激素進行分離和分析。Acquity超高壓液相色譜系統(Waters)由脫氣器、二元梯度泵、自動進樣器(5℃)和柱式烘箱(40℃)組成。所有化合物均使用UHPLC KinetexTM2.6 um XB-C18100 a LC (50 x4.6 mm)柱在單一梯度運行中分離。色譜條件為流速1mL-min，進樣量10μL。采用 AB SCIEX API-5000TM三重四極桿(Applied Biosystems/MDS SCIEX)，在負模式下電噴霧電離(ESI)，通過多重反應監測(MRM)檢測分析物。流動相為水:ACN(50:50)等壓相。MS參數分別為cad氣體和幕壓8 psig和10 psig,GS1/霧化器和GS2/渦輪氣體流速分別設置為20L-min。離子噴霧電壓(IS)固定構-4500V，源溫度固定為400℃。
方法驗證
驗證是根據國際分析方法驗證統一會議的指導方針進行的。這些準則通常用于制藥業的產品純度測試，而不是用于環境監測;然而，一些測試在驗證上是相似的。本研究按照以下標準對方法進行驗證:線性度、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)、日內精密度(重復性)和日內精密度(再現性)。線性通過決定系數(R2>0.98)和響應因子間變異系數(CV<15%)驗證各分析物的校準曲線線性。為了生成校準曲線，制備了標準的雌激素混合物，得到五種不同濃度的溶液(10 ng-mL-'，50 ng-mL,100 ngmL-，500 ngmL和1000 ngmL)。加入0.5g(干基)堆肥樣品。
結論
建立了超聲溶劑萃取-固相萃取-超高效液相色譜-質譜聯用分析的同時提取、檢測和定量生物感染性危險廢棄物堆肥中4種雌激素的方法。該方法符合國際分析驗證統一會議的的驗證標準。獲得了適宜的線性水平。適當的樣品制備、以甲醇為提取溶劑的超聲波提取、用HLB 60mg-6ml Supelco和乙腈重構洗脫液進行充分的清理是保證四種雌激素高回收率的必要條件。使用水和ACN(50:50)的等溫流動相，在負模式下電噴霧電離，僅在1.5分鐘內實現了適當的化七合物分離。LC0Q在文獻中報道的類似基質(如土壤、改良土壤、污泥、消化污泥、沉積物和堆肥生物固體)的值范圍內。因此，該亥分析方法被推薦用于測定與使用的具有負電離和類似結構的雌激素。它的應用將有助于有合適的化合物回收率，可接受的檢測和定量水平。