質譜沙龍第三十四期活動報道

　　2011年12月4日，第三十四期質譜沙龍活動在第二炮兵總醫院藥學部成功舉行。本次沙龍探討了質譜技術在臨床藥物監測（TDM）和食品中過敏原物質檢測方面的應用，并有華質泰科（ASPEC）公司首席技術官劉春勝博士為大家帶來了國際前沿的液滴萃取表面分析（LESA）技術及其應用。來自第二炮兵總醫院、北京安定醫院、中科院高能所、中國計量科學研究院、中國環境科學研究院、北京師范大學醫院、AB SCIEX公司、華質泰科生物技術（北京）有限公司、北京艾米諾醫學研究有限公司等，二十余位專家、學者、技術工程師參加了本次沙龍活動。

第三十四期質譜沙龍活動現場

第三十四期質譜沙龍活動現場

質譜檢測技術在臨床治療藥物監測（TDM）中的實際應用

　　第二炮兵總醫院李鵬飛老師作了題為《質譜檢測技術在臨床治療藥物監測（TDM）中的實際應用》的報告，介紹了臨床治療藥物監測（TDM）的概念方法，他克莫司及試劑盒開發、環孢素TDM工作、免疫抑制劑及其合并用藥、以及中毒檢測和內源性小分子等相關研究工作，并簡要介紹了所在實驗室的質譜檢測平臺、科研工作和科研活動。

第二炮兵總醫院 李鵬飛 老師

　　治療藥物監測（TDM）介紹

　　治療藥物監測（“血液濃度監測”TDM）是對治療指數窄、毒性作用強、個體差異大的藥物，測定其血液或其他體液中的藥物濃度，根據藥動力學原理制定個體給藥方案。按照“醫院管理評價標準”的規定，醫院應當開展治療藥物監測，推廣個體化給藥方案。傳統的治療方法是參照教科書上推薦的平均劑量給藥，其結果是僅一些患者得到有效治療，另一些則未能達到預期的療效，甚至出現了毒性反應。TDM藥物具有明顯的特點：安全范圍窄，治療濃度范圍與中毒濃度很接近，如地高辛；無明顯的、可觀察的治療終點或指標，無及時的、易觀察的、可預知療效的臨床指標，如抗癲癇藥物；劑量、藥物作用之間的關系不可知，同一劑量，不同患者可出現有效、無效、中毒等不同反應，如苯妥英鈉；藥物中毒與無效時均危險，如抗排異藥物；藥物血液濃度與臨床作用、中毒之間有一個較好的關系。目前臨床主要監測的品種有慶大霉素、萬古霉素、環孢霉素A、卡馬西平、地高辛、丙吡胺等。

　　國內治療藥物監測主要光譜法、免疫法、色譜法等。光譜法一般有比色法、紫外分光光度法、熒光法等，靈敏度比較低，只能監測體液中藥物濃度在1.0μg/mL以上，并且代謝物或結構相近化合物對監測的干擾較大，該法基本淘汰。免疫法利用蛋白競爭的原理進行監測，放射免疫法、酶免疫法、熒光免疫法、均相酶免疫法等，方法樣品處理簡單，獲取結果時間較短，已成為臨床用于評判療效的一個重要依據，是國內臨床通用方法。色譜法有HPLC法、氣相色譜、高效毛細管電泳法、LC-MS法等，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點，檢測值更接近真實值，國外廣泛使用。LC-MS/MS進行TDM具有快速、多組分同時測定，專屬性強、靈敏性和準確度高、重現性好，性價比高等優勢。患者能夠獲得安全有效的治療，達到器官移植的最終目標，降低急性排斥反應發生率和感染風險，而且檢測及藥品費用降低;醫生可以得到準確的檢測結果，做出高效安全的治療方案，提高了病床周轉；醫保部門也可以多方位節約成本，如檢測費用和治療費用；醫院也可節省醫療資源，增加學術和經濟收益，提升市場競爭力。

　　李老師對TDM市場作了簡要分析，以監測他克莫司為例。全國約有1.5萬移植患者，每例移植患者每年監測20次，監測市場9000萬元，LC-MS占市場的1/5，約2000萬元。快速、準確的治療藥物監測結果是“以病人為中心”臨床個體化工作的需要，也是提升醫藥水平市場競爭力的需求。隨著分析技術的不斷發展，LC-MS/MS法將逐漸取代免疫分析技術成為TDM的常規方法。它的低成本、高準確度將是患者以及醫療人員的福音。

　　相關研究工作

　　他克莫司監測起源于生物等效性試驗研究，由于免疫法檢測費用高、靈敏度低，而且血藥濃度個體差異大，所以李老師采用了液質聯用技術，并于2007年申請了《藥物代謝酶基因多態性和LC-MS/MS技術聯合指導他克莫司個體化給藥臨床應用》的課題，得到了首都醫學發展基金的支持，該課題建立了LC-MS/MS方法監測血液濃度，研究了基因多態性。液質參數如下表，樣品前處理流程見下圖。

色譜柱	Shim-pack VP-ODS柱
流動相	乙腈-10mmol·L-1乙酸銨梯度洗脫
流速	1.0mL·min-1
柱溫	50℃
進樣量	20μL
離子源	離子噴霧離子化源（ESI）正離子方式檢測
掃描方式	多重反應監測（MRM）
DP電壓	60V
CE電壓	21eV

樣品前處理流程

　　李老師采用LC-MS/MS法測定他克莫司，考察了其專屬性、準確度、精密度、線性和定量限結果，相對標準誤差在10%以內，線性范圍為0.5-50ng/mL（MEIA法1-30ng/mL），相關系數都接近3個9，檢測限為0.05ng/mL，靈敏度高，線性好。另外，李老師考察了LC-MS/MS法與MEIA法測定肝移植患者全血樣品結果，共8個試驗批次，800多個樣本，得到了很好的相關性，而后又做了9個試驗批次。對74例健康者進行分析，FK506的主要代謝酶是細胞色素CYP3A5，中國人群的基因背景與白種人和黑人有很大的差異。該方法是創新的檢測方法，用于他克莫司的LC-MS/MS法檢測試劑盒是SFDA第一個批準的，是全國第二個獲批的LC-MS/MS試劑盒產品，批準文號是京藥監械（準）字2009第2400778號。

　　對于環孢素的研究，李老師采用了HPLC-MS/MS分析法、TDx分析法和蛋白沉淀板法。HPLC-MS/MS分析法是精密取50μL全血樣本，置于1.5mL EP管中，加入50μL紅細胞破碎劑，200μL內標CsD，渦旋2min，13200r/min離心5min，取上清液，進樣20μL，進行HPLC-MS/MS分析，得出結果需3min，檢出限10ng/mL。TDx分析法取全血樣本150μL，加入紅細胞破碎劑50μL，混勻，再加300μL蛋白沉淀劑混勻，離心5min，取上清液150μL，置TDx儀內測定，得出結果約需15min，檢出限100ng/mL。蛋白板沉淀法是將HPLC-MS/MS分析法上清液通過蛋白沉淀板處理，抽濾后再加入600μL乙腈沖洗藥物。取上清液，進樣20μL，進行HPLC-MS/MS分析，得出結論需3min，檢出限10ng/mL。然后，對TDx和HPLC-MS/MS進行相關性分析，并比較HPLC-MS/MS法和TDx分析法測定全血中環孢素A批次-濃度曲線圖，以及比較MAS沉淀板與蛋白沉淀質譜法測定全血中環孢素A曲線圖。李老師得出結論，HPLC-MS/MS分析方法測定濃度值/TDx法測定濃度值平均值為（54.8±7.35）%，中國人群比值首次被我們提出并用于TDx法推測HPLC-MS/MS法治療窗。MAS沉淀板法使細胞中的藥物釋放出來，并且樣品處理更干凈，濃度升高，跟TDx檢測濃度具有很好的相關性，具有較高相關系數和統計學意義。

　　接下來，李老師簡要介紹了免疫抑制劑及其合并用藥，并講了一些中毒檢測、內源性小分子檢測等拓展工作。中毒篩查發生情況統計顯示3、5~7、11~12月為高發期，且以女性為主，比例約是男性的2倍。檢出藥物累計總數277個，計91種，根據統計，應加強艾司唑侖、地西泮、咖啡因等藥品的管理和流通，防止用藥過量和自殺性用藥。李老師所在實驗室08年與國外實驗室交流與技術共享，成功建立了定量檢測人體內42種氨基酸的標準方法。現初步建立起適用于中國人群的正常血氨基酸水平，可明確地根據直觀圖表，判斷體內的氨基酸平，提供個體的營養、代謝、健康狀況，并提供相應的改善意見。

　　實驗室情況

　　李老師所在實驗室的質譜檢測平臺，在2006年3月安裝了3200 QTRAP型液相色譜儀，并在2009年3月買了第二臺質譜儀，同時還配備了氮吹儀、固相萃取儀、高精度天平、高速離心機等，進一步完善了該平臺。質譜檢測技術平臺的功能包括中毒藥物快速篩查(全國首家)，體內藥物分析測試平臺，I期新藥試驗測試平臺和體內生物小分子定量分析（全譜氨基酸、新篩）等。目前，實驗室已完成30余項新藥I期藥代動力學研究的檢測項目；開展了LC-MS/MS高通量篩查和評估人體內火箭推進劑中毒水平的研究；開展特色臨床檢測：全譜氨基酸檢測，中毒藥物檢測，他克莫司檢測（國內第二個LC-MS/MS試劑盒）；參與多項對外檢測服務；現在正在進行氯吡格雷和雷奈酸鍶-雷奈酸的藥代動力學研究。實驗室科研活動豐富多彩，參加了諸多學術會議，對內部員工進行了專業培訓，還成功舉辦了34期質譜沙龍活動，40余單位150余朋友參加，為質譜一線技術人員提供了活躍的交流平臺。

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基于芯片多通道納噴質譜的液滴萃取表面分析（LESA）

　　華質泰科生物技術（北京）有限公司首席技術官劉春勝博士為大家作了題為《基于芯片多通道納噴質譜的液滴萃取表面分析（LESA）》的報告，主要介紹了芯片多通道納噴離子源（TriVersa NanoMate^?），并詳細講解了其三大功能模式之一——LESA?（液滴萃取表面分析），以及它在AB SCIEX 質譜系統上的應用。

華質泰科生物技術(北京)有限公司首席技術官 劉春勝 博士

　　芯片多通道納噴離子源

　　芯片多通道納噴離子源（TriVersa NanoMate^?）是Advion公司研制推出的最新的、基于芯片的納升電噴霧離子化（Chip-based ESI）技術，它是集液相色譜（LC）、質譜（MS）、芯片納升注射（Chip-based Infusion）、餾分收集（Fraction Collection）和液滴萃取表面分析（LESA）等優勢于一身的新穎的液質聯用（LC/MS）伴侶產品。不同于傳統的單一模式的液質聯用分析，TriVersa NanoMate^?更適用于通量分析復雜的生物基質樣品，以發掘更加豐富的化學和生物學信息。

芯片多通道納噴離子源(TriVersa NanoMate^?)

　　芯片多通道納噴離子源（TriVersa NanoMate^?）的原理是，通過成像技術和數碼控制，精確定位樣品采樣點，用一滴溶劑對樣品或組織進行表面微萃取，萃取液經由基于芯片的納升電噴霧離子化(Chip‐based ESI)，進行串聯質譜分析。它有三種功能模式：芯片注射分析，與LC/MS分析同步進行餾分收集，LESA?（液滴萃取表面分析）。TriVersa NanoMate^?的ESI芯片是通過微型化釋放質譜能量，這種微流控芯片包含刻蝕于硅晶片上的400個納升電噴霧噴嘴，芯片的加工方法高度重現，確保了噴嘴的一致性，通過納升級電噴霧噴嘴產生的電場使噴霧更有效、更穩定。芯片軟件是TriVersa NanoMate^?擁有知識產權的ChipSoft?，可以對各種參數（如進樣體積、進樣流速、溫度和噴霧時間等）進行調節和控制，當噴霧失效（如發生噴頭堵塞），儀器會自動移向下一個可用的噴嘴，保證樣品電噴霧的連貫性，此過程在3秒內完成。

ESI芯片

ChipSoft?軟件

　　LESA?（液滴萃取表面分析）

　　TriVersa NanoMate^?現在有一種新的采樣模式，能夠通過浸漬直接從各種表面萃取樣品，經納升電噴霧離子化后來分析。液體萃取表面分析（LESA）由美國橡樹嶺國家實驗室（ORNL）的Vilmos Kertesz 和Gary J. Van Berkel于2009年發明并申請ZL，該技術隨后被授權給美國Advion BioSystems, Inc. (Advion) 公司，由Advion對其進行了技術改進和一體化、自動化設計，于2010年3月份完成了商品化，推向全球市場。LESA?可以更靈敏的分析更多的化合物，而且快速、簡單、直接。它廣泛應用于小分子和大分子分析，如薄的組織切片，TLC薄層板和其它平板分離介質，紙質干血斑，MALDI樣品板進行互補的ESI分析，以及對任何含有可萃取物質的表面進行分析。

　　LESA?是怎樣工作的呢？TriVersa NanoMate^?首先從吸管架移取一個移液吸頭，然后從溶劑瓶中吸取萃取溶劑，將吸取的溶劑推向樣品板，使溶劑液滴與樣品表面接觸，溶劑自樣品表面萃取分析物，將溶劑再次吸回槍頭，使吸頭緊貼于ESI芯片的背面，自然密封，施加電壓和少許輔助氣壓，使發生電噴霧離子化。

LESA?工作流程示意圖

　　LESA?與AB SCIEX質譜系統

　　美國橡樹嶺國家實驗室（ORNL）開發的液體萃取表面分析（LESA）技術，使TriVersa NanoMate^?能夠對各種表面進行快速、直接的ESI質譜分析，該技術具有對用戶友好、方法開發容易、快速簡單、信息豐富和靈敏度高等優點。LESA?與AB SCIEX質譜系統配合使用，大大提高了其質譜性能，使之能夠分析更多的化合物，獲得更豐富的信息。另外，LESA?還可與安捷倫、賽默飛、布魯克等廠商的質譜儀器兼容。

LESA?與AB SCIEX質譜系統配合使用

　　相關產品：芯片多通道納噴離子源(TriVersa NanoMate^?)

食品中過敏原的LC-MS/MS檢測新方法

　　AB SCIEX 公司殷曉燕老師向大家作了題為《食品中過敏原的LC-MS/MS檢測新方法》的報告，比較了食品中過敏原物質的檢測方法，并介紹了AB SCIEX 獨家率先發布的多種食品中過敏原同時進行檢測的方法包。

AB SCIEX 公司 殷曉燕 老師

　　過敏原又稱為致敏原或變應原，是指能夠使人發生過敏的抗原，特點是接觸過敏原一定時間后，機體致敏，反復接觸后可出現過敏性癥狀，一般會逐漸加重。過敏原來源復雜，分為食物過敏原、接觸性過敏原、有毒物質過敏、空氣過敏原和注入性過敏原，食物過敏原又分為食物過敏蛋白質（植物性、動物性）、食品添加劑和轉基因食品等。全世界8%兒童和2%成人對食物過敏，發達國家近20%的人受食物過敏性疾病的困擾，美國兒童6%、成人3.7%發生食物過敏，我國重慶5%兒童食物過敏，而且呈現上升趨勢。

　　過敏原檢測方法比較

　　過敏原廣泛存在含膚質/谷蛋白的谷類、甲殼類、蛋類、魚類、花生類、大豆類、牛奶類、堅果類、芹菜類、芥末類、芝麻類等食物中。PCR方法不是過敏原檢測的首選方法，食品工業化加工通常采用/添加某些成分，可能是DNA與蛋白質分離，PCR方法可能產生危險的假陰性結果;ELISA利用抗體檢測蛋白質，過敏原蛋白質結構在加工過程中會發生變化，導致假陰性結果。三種檢測方法特點見下表。

	ELISA	PCR	LC-MS/MS
檢測原理	蛋白質	DNA	蛋白質/肽（標志物）
靈敏度	1-10ppm	低	1-10ppm
定量	是	RT-PCR（semi）	確證
假陰性/假陽性	是	重要標志物（DNA）	無
專有程序	是（需要抗體）	是	無
費時	是	是	一般

　　MRM在定量已知蛋白方面優點明顯：檢測靈敏度比傳統的掃描模式高500-1000倍，特別適合低豐度蛋白質的鑒定——定性方面最顯著的優點；定量的線性范圍寬，>6個數量級，特別適合樣品含量有顯著差異的樣品分析；掃描速度快，結合Schedule MRM軟件，一次質譜掃描實驗可以完成幾百對MRM，因此可以同時檢測幾百種蛋白質的含量的變化；采用MRM方法定量已經成為小分子領域定量的黃金標準，技術成熟，使用簡便，在蛋白質組學的應用現在正處于黃金時期，結合生物樣本，容易出高檔次文章。MRM之后，一定要進行MS/MS確證，目的是確認我們計算肽段面積所用的MRM峰，確實來自于該肽段，而不是其它肽段，因為一段肽段產生的碎片有幾十上百個，二級譜圖非常復雜，如果沒有完整的MS/MS，極有可能產生假陽性。QTRAP系統是一種雜合了三級串聯四極桿和線性離子阱的質譜儀，有獨特的蛋白質定量流程MIDAS，有助于優化MRM離子對，消除干擾MRM離子對和去除假陽性MRM。

　　多種過敏原同時檢測方法包

　　AB SCIEX 公司獨家率先發布，多種食品中過敏原同時進行檢測的方法包iMethod?。Cliquid?一站式整體解決方案平臺，用于常規食品分析檢驗。簡單的四步流程——選擇檢測項目、建立樣品列表、定制報告、提交樣品，可以輕松實現大通量進樣分析工作。應用MIDAS?工作流程，殷老師檢測了餅干、牛奶、小麥、雞蛋、意大利面和面包中的過敏原，都獲得了良好的線性和優異的重復性。

　　最后，殷老師對報告內容作了總結。AB SCIEX 開發的LC-MS/MS分析方法，可以分析幾種主要食品（花生、牛奶、小麥和雞蛋）中的過敏原，具有快速、穩固、靈敏和專一等特性；靈敏度與現行的ELISA和實時的PCR方法等相當，但是CV無需內標，特別是在低濃度時比ELISA方法更優異；LC-MS/MS方法可以同時檢測多種過敏原，而每種ELISA方法只能檢測一種過敏原；利用MIDAS? workflow全掃描QTRAP^?MS/MS圖譜，同時進行多肽定性和定量確認，消除了ELISA和PCR方法固有的假陰性和假陽性結果；QTRAP^?線性離子阱（LIT）由于MS/MS高靈敏度性能成為過敏原檢測的最佳平臺。