誘變PCR實驗

氯仿 異戊醇 乙醇 礦物油或者一個蠟珠 3mol L NaOAc 5 mmol L MnCl2 突變 PCR 緩沖液 DNA 聚合酶 Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶 高純度的脫氧核苷 5'-三磷酸 dNTP 混合物 模板 DNA 引物 瓊脂糖凝膠用溴化乙錠染色

熱循環儀

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

氯仿/異戊醇（24:1，體積比）

乙醇，100%

礦物油或者一個蠟珠

3mol/L NaOAc,pH5.2

5 mmol/L MnCl₂

1X 突變 PCR 緩沖液

70 mmol/L MgCl₂

500 mmol/L KCl

100 mmol/L Tris-HCl,25°C 時 pH8.3

1g/L 明膠

2. 酶和酶緩沖液

DNA 聚合酶

Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶（Applied Biosystems 或者其他有執照的供應商不要用其他熱穩定 DNA 聚合酶替代

3. 核酸和寡核苷酸

高純度的脫氧核苷 5'-三磷酸（Pharmacia，USB/Amersham)

10XdNTP 混合物，包含 2 mmol/LdGTP、2 mmol/LdATP、10 mmol/LdCTP 和10mmol/LdTTP

模板 DNA

引物

4. 凝膠

瓊脂糖凝膠用溴化乙錠染色

5. 特殊設備

熱循環儀

二、方法

1. 準備 10X 突變 PCR 緩沖液。

2. 準備10XdNTP 混合物。

3. 準備一個 5 mmol/LMnCl₂ 溶液，不要與 10XPCR 緩沖液混合，否則將產生沉淀干擾 PCR 的擴增。

4. 將 10ul 10X 突變 PCR 緩沖液、10ul lOXdNTP 混合物、每種引物各 30pmol 以及20fmol 模板 DNA 混合在一起，用 H₂0 將總體積補齊至 88ul，然后混勻。

5. 添加 10ul 5 mmol/L MnCl₂ 溶液，充分泥勻確保沒有沉淀形成。

6. 添加 5U(2ul)Taq DNA 聚合酶，將最終體積定為 100ul, 輕輕混勻。如果需要的話，可以覆蓋礦物油或一個蠟珠。

7. 以 94°C 1 min、45°C1 min、72°C lmin 溫育 30 個循環。不要設定熱啟動步驟，也不要在最后一個循環的末尾設定延長的延伸時間。

8. 純化反應產物，首先用氯仿/異戊醇（24:1, 體積比）抽提，隨后用 0.25mol/LNaOAc 和 2.5 倍 100% 乙醇沉淀。

9. 將一小部分純化的產物在瓊脂糖凝膠中檢測，經溴化乙錠染色后確認全長的產物的量是否令人滿意。突變 PCR 應該與標準 PCR 平行進行（忽略上面所列的 4 點不同這兩種 PCR 所得到的全長 DNA 的量應該相差不多。