表達基因的克隆策略與分離表達基因序列的技術方法

人類基因組計劃的主要任務之一就是要從大片段基因組區域或整條染色體DNA 上鑒定出基因表達序列(gene expressed sequences)或轉錄單位(transcription units)。在人類基因組30億個堿基對中，發生轉錄的表達序列(即基因)僅占總序列的3～5％。基因組中絕大部分是基因間隔序列(intergenic seguences)或內含子(intron)和各種各樣的重復序列。測定基因表達序列可直接鑒別人類目前認定的6～1 0萬(或僅3～5萬)個基因在染色體上的位置和排列順序，這就是人類基因組計劃所要構建的 第四張圖譜——基因表達圖譜，又稱基因轉錄圖譜(gene）

表達基因的克隆策略

基因克隆(gene cloning)是指從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA序列，再通過DNA序列擴增形成由眾多拷貝組成的一個DNA片段群體的過程。目前，廣泛應用于致病基因分離與克隆的策略可歸納為位置克隆(positional cloning)、候選位置克隆(candi date positional cloning)、表型克隆(phenotypic cloning)等。

一、定位克隆

定位克隆的總體思路是疾病——染色體定位——基因序列——mRNA/cDNA——蛋 白質 (致病基因產物)。定位克隆是通過分析患病家系的連鎖關系確定致病基因的遺傳方式，從染色體畸變引發的疾病入手，將染色體畸變的位置作為疾病基因克隆的一個位點進行分析的一種克隆策略

二、定位候選克隆

定位候選克隆是定位克隆的一種改進方法，是目前被認為最有發展前途的基因定位策略。人類基因組草圖問世之后，所有人類致病基因將很快被定位在染色體的某個區域，這樣，可從某局部的序列片段中篩選出致病基因進行結構與功能分析，這就是定位候選克隆。

1、染色體區域定位

定位候選克隆的基因區域定位多采用PCR法、FISH技術、染色體顯微切割和輻射圖譜等方法篩選致病基因(包括腫瘤易感基因)的基因組雜合性丟失(loss of heterozygosity,LOH)的高 頻率區，從而對致病基因進行定位候選克隆。

2、致病基因的候選cDNA篩選

在致病基因被介定于狹窄的DNA重疊克隆區域的基礎上，對該區域中的基因位點進行測序，將變異位點的核苷酸序列與正常序列進行比較，可確定致病基因的位置。隨著區 域性 基因圖譜的構建和標記位點的增多，從相互重疊的克隆群中篩選候選cDNA即篩選致病基因的表達序列和基因定位的步伐會大大加快。

3、全長cDNA及基因結構與功能分析和鑒定

獲得了大量的候選cDNA后，通過篩選cDNA文庫或采用cDNA末端快速擴增(RACE)等方法克隆全長基因。確定其中致病基因的重要環節是對定位候選克隆進行功能分析，這需要對患病家系中的可能致病基因進行檢測。

三、表型克隆

表型克隆策略不依賴于基因的染色體位置或基因的產物信息，只從疾病的特征出發，比較疾病DNA與正常DNA水平的差異并直接對變異的DNA進行分離。該策略是疾病基因克隆中的一種新策略。這種策略的典型技術方法是代表性差異分析(representative difference analysis, RDA)。

分離表達基因序列的技術方法

一、連鎖分析與致病基因定位

當染色體上控制這些性狀的基因位點相距很近時，在減數分裂過程中位點之間發生染色體單體交叉和等位基因互換的機率較小，相鄰的基因位點就有較大的機會以連鎖方式傳遞給后代，即兩位點越近，發生染色體交叉 和基因重組的可能性越小。位點間的距離用重組率或重組分數(recombination fraction . Ott J,1991)進行估計。即：重組分數＝重組配子數/（重組配子數 非重組配子數）

二、利用染色體畸變進行基因定位與分離

若發現某種疾病與染色體變異直接相關，致病基因就可定位在一段相對較短的染色體變異區域，通過連鎖分析將基因分離的目標初步定位在10～20Mb區段內，使要分離的目標基因大大縮小，省去了大量繁瑣的全基因組連鎖分析，大大加快了該基因的定位和分離速度，再通過篩選DNA文庫、外顯子捕獲(exon trapping)和比較基因組雜交(comparative genome hybrid izatien)等表型策略獲得致病基因。

三、cDNA選擇法

基因組圖譜繪制和基因定位克隆的常見問題是大片段基因組編碼DNA的鑒定。為解決此問題，1991年，Parimoos 等首先提出了cDNA選擇法。此法采用cDNA片段與固定在膜上的DNA進行雜交并通過PCR回收候選cDNA，用YAC、粘粒克隆擴增cDNA，進行基因組DNA大片段編碼序列的迅速克隆。

四、CpG島法

CpG島(CpG island)是基因組DNA序列中富含C、G的DNA區域。在大規模的DNA測序中，每發現一個CG島，意味著在此有一個基因。利用CpG島稀有酶如 SacⅡ、BssHⅢ、Eag Ⅰ、HpaⅡ、NotⅠ識別其位點，切割基因組DNA。CpG島又稱HIF島，即用HpaⅡ酶將CpG島周圍的DNA切成許多小片段，這些序列稱為HIF序列。用位于CpG附近的序列作探針，從總DNA文庫 或cDNA文庫中得到轉錄子，鑒定表達基因。

五、基因表達序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)

特點：Velcule scu VE 等(1995)率先提出的一種分析基因表達的新策略，其主要特點是能在短期內采用PCR或手動測序等通用儀器得到大量的表達信息，并能對不同狀態下的表達基因進行定量和定性的檢測，比較完整地直接讀出基因表達的信息，因此，SAGE技術在研究表達基因測序上有較大的發展潛力。與cDNA選擇法相比，基因序列表達分析能減少大量的重復測序，大大節省研 究時間和費用。

六、動物基因組印跡雜交

動物基因組印跡雜交(Zoo blot)是基于人類及其他動物在長期進化中普遍存在基因的同源和保守序列的理論設計的。該方法采用同一基因單拷貝的分子探針與各種動物的基因組DNA作Southern印跡雜交篩選，如果雜交表現為陽性，表明所用的探針中可能包含進化過程中的保守序列，即序列間有很高的同源性，該序列可能是外顯子或編碼表達基因區域， 進而分離基因組中的表達序列。

七、基因差異表達

生物體在不同發育階段、不同生理狀態下、不同類型細胞或組織中的結構與功能 的變化的差異歸根結底是基因在時間與空間上的選擇性表達差異，即為基因的差異表達。

基因差異表達的研究策略主要建立在基因轉錄和翻譯的調控過程中，即mRNA差異或cDNA差異 和蛋白質差異兩個水平，研究較多的是mRNA或cDNA水平。