(1)內皮細胞遷移試驗
內皮細胞遷移是血管生成的標志之一，也是血管生成級聯反應的早期步驟之一。
傷口愈合試驗：細胞培養、傷口愈合試驗是表征細胞遷移活性的基本讀數之一。血管內皮細胞在培養皿中培養至融合，用刀片/移液管尖端在孔的中間形成一個直的間隙。洗滌并去除漂浮的細胞。將細胞培養一段時間后，在顯微鏡下觀察細胞遷移圖像。對細胞遷移的距離進行可視化，并通過image-Pro Plus分析軟件捕獲圖像（如圖8）。
圖8.采用傷口愈合法檢測HUVECs的遷移情況。
(2)內皮細胞增殖試驗
在過去的幾十年里，已經發展出了許多不同的解決細胞增殖的方法。一般來說，這些方法包括細胞數量的評估、通過摻入標記的核苷酸類似物來檢測DNA合成、DNA含量的測量、增殖標記物的檢測和代謝分析（如圖9）。
?細胞計數：自動細胞計數器或血細胞計數器
?DNA標記：3H-thymidine、BrdU、edu、PI、DAPI、Fucci
?增殖標志物：PH3、PCNA、Ki67
?代謝分析：MTT測定
圖9.內皮細胞增殖試驗。a.在常規的96孔板上生長的HUVEC的相位對比度圖像（左）和二值化圖像。b.MTT檢測的例子，顏色強度與細胞數量相關。c. PI檢測HUVECDNA染色，平板細胞儀測量。d. HUVEC用sunitinib處理后的細胞活力，發光法測定。
(3)血管形態發生的3D模型
通過血管發生或血管生成，血管網絡的出現需要細胞形成穩定的3D管，這一過程涉及這些細胞的分化、遷移、增殖、聚集和重排，形成索，然后形成管腔。綜上所述，這個過程被稱為血管形態發生。隨后，EC招募血管周圍的間質細胞（周細胞）來穩定這個新形成的網絡，并減少血液灌注時的滲漏。血管形態發生的三維分析如圖10所示。
?纖維蛋白珠測定
?膠原蛋白測定
?視網膜外植體測定
?血管化的微器官平臺（VMO）
圖10.血管形態發生的三維分析。a. I型膠原蛋白和EC包覆的細胞珠嵌入在3D纖維蛋白凝膠基質中，以測量EC的發芽和管腔形成。b. 相差顯微鏡觀察EC發芽和管腔形成。c. EC管的形成可以通過將EC嵌入I型膠原基質中來測量。d.一旦形成，這些管腔可以通過甲苯胺藍染色和亮視野顯微鏡觀察到。e.將出生后小鼠的完整的解剖視網膜包埋在I型膠原-基質膠混合基質中，并在促血管生成培養基中培養，以刺激EC發芽。f.相差顯微鏡觀察小鼠視網膜血管形態發生。g.VMO平臺利用了“小動脈”（高壓）和“小靜脈”（低壓）微流控通道，這些通道通過在介入的組織室內通過血管生成形成的活微血管網絡連接。h. 用70kDa的FITC-dextran（綠色）灌注，可以測量形成的微血管系統(EC，紅色)的滲漏。
(4)主動脈環試驗
大鼠或小鼠主動脈外植體在ECM凝膠中時，具有體外發芽和形成分支微血管的能力（圖11）。該系統中的血管生成是由主動脈釋放的內源性生長因子及其在解剖過程中響應損傷時的生長所驅動的。主動脈壁的這種特性在20世紀80年代早期首次被描述，并導致了主動脈環檢測的發展，現在被廣泛用于研究血管生成的基本機制和測試促血管生成或抗血管生成化合物的療效。
圖11.主動脈環實驗。a.第6天拍攝的大鼠主動脈無血清膠原凝膠培養（星號）（箭頭標記的微血管）。b.用VEGF(5ng/ml)處理的主動脈培養顯示微血管數量增加（第6天）。c.主動脈來源的微血管(E)、未閉腔(L)和周圍周細胞(P)的電鏡圖；內皮緊密連接用箭頭表示。d.由內皮細胞的內核和周圍的周細胞組成的微血管的相位對比顯微圖（白色箭頭）。e.NG2免疫過氧化物酶染色突出顯示周細胞。f.主動脈來源的巨噬細胞的免疫熒光圖像；在背景中可見一個植物凝集素IB4標記的內皮芽。g.內皮細胞(IB4)和周細胞(αSMA)雙染色的微血管共聚焦圖像。
(5)腫瘤微血管密度及腫瘤中的組織病理學生長模式
微血管密度(MVD)常被認為是腫瘤血管生成的替代標志物。組織病理學生長模式(HGPs)是根據腫瘤與周圍正常組織界面處的形態學特征來定義的。
非血管生成腫瘤的流行及其對抗VEGF治療的耐藥性需要識別一種準確反映這種類型腫瘤生長的生物標志物。HGPs是一個很好的候選生物標志物。用泛內皮抗體免疫染色的腫瘤切片上的血管模式和使用標記內皮細胞參與新生血管生成的抗體是其他潛在的區分非血管生成和血管生成腫瘤的組織病理學方法。通過CD31對正常肝（a）組織、結直腸癌肝轉移（b）和（c）組織進行染色，通過不同方法計算微血管密度模式，發現與血管生成、結締組織增生的肝轉移形成對比，后者顯示的血管熱點數量明顯高于正常肝組織和非血管生成的肝組織（如圖12）。
圖12.微血管密度和組織病理學生長模式a.正常肝臟中血管模式的無監督空間建模顯示，每個血管輪廓的簇數量很低。b.具有替代生長模式的結直腸癌肝轉移患者的血管模式的無監督空間建模顯示，每個血管輪廓的簇數量較低。c.對具有結締組織生長模式的結直腸癌肝轉移中的血管模式的無監督空間建模顯示，每個血管輪廓中都有大量的簇。a-c.相同的顏色表示相同的微血管密度模式。d.結締組織生長模式、替代生長模式和正常肝臟的標準化血管物體簇的數量的Tukey箱形圖。
(6)腸套疊血管生成試驗
血管生成是血管的從頭形成，可以跟隨發芽或非發芽的過程。一個重要的非發芽機制是腸套疊（自身生長；也稱為血管分裂）。
血管鑄造已被廣泛用于三維顯示腸套疊血管生成。該方法是基于創建一個微血管系統的血管復制品。采用甲基丙烯酸甲酯或PU4ii作為鑄造介質，灌注后幾小時，切除器官，轉移到15%的KOH中2-4周，以溶解組織。洗滌后，鑄件在一系列不斷增加的乙醇濃度中脫水，并在真空干燥器中干燥，并用掃描電鏡檢測（如圖13）。
圖13.腸套疊血管生成—方法上的挑戰。a.掃描電鏡觀察血管的管腔（星號）的形成。b.對再生斑馬魚鰭血管系統的動態體內觀察顯示了一個新形成的柱（矩形）。c.來自b圖的三維重建模型。d.透射電鏡顯微圖顯示了在超微結構水平上的腔內組織柱（b，c中的矩形）。黑色星號表示柱狀細胞的核心，箭頭表示內皮細胞(EC)之間的細胞-細胞接觸。
(7)血管內皮生長因子c (VEGFC)的體內萌芽淋巴管生成實驗及AAV介導的基因轉移
淋巴系統在體內維持組織液穩態、脂質吸收和免疫細胞運輸中起著關鍵作用。指導淋巴細胞生長的最重要的受體信號轉導系統是VEGF-C/VEGFR-3系統。通過轉基因過表達或病毒基因傳遞系統提高VEGF-C的組織濃度會導致淋巴過度生長。研究淋巴管生成的技術有耳海綿試驗和病毒基因傳遞技術（如圖14）.
圖14.體內淋巴管和血管的生長。a-c.淋巴管生成的明膠海綿的制備。d-f.AAV的制備和骨骼肌的轉染。
(8)人內皮細胞和周細胞無血清3D共培養
該分析模型的主要好處和優勢在于其高再現性和高重復數，因為它是在半面積96孔板中進行的。周細胞招募到EC管的結果可以通過檢查基底膜沉積（通過免疫熒光染色或透射電子顯微鏡），或通過測量毛細管的寬度和長度來揭示。最后，實時視頻分析可以用于監測周細胞和內皮細胞的運動，因為它們在三維基質中與異常招募的周細胞共同組裝形成管狀網絡（如圖15）。
圖15.人內皮細胞-周細胞管與3D膠原基質共組裝的無血清培養體系。120h固定的培養物用CD31、層粘連蛋白(LM)和纖維連接蛋白(FN)的抗體進行免疫染色，并用共聚焦顯微鏡成像或透射電鏡檢查。箭頭表示毛細血管基底膜。L表示管腔，Nuc表示細胞核標記。
(9)內皮細胞共培養球體實驗
體外2D單層細胞培養及其向臨床環境的轉化/延伸的研究有其局限性，因為它們不能模擬體內環境中的營養和氧梯度。臨床前3D共培養球體分析有助于細胞內/細胞間串擾模擬體內血管結構，例如管腔形成和極化，并且在兩種或多種細胞類型具有自然粘附和分層特性的情況下，對于探索這些相互作用特別有價值。
多細胞三維球狀體可以通過多種方法生成，包括：（1）使用（超）低結合板自發形成球狀體；（2）“吊墜”技術；（3）懸浮培養（例如，通過旋轉燒瓶或生物反應器）；（4）基于支架的模型（例如，水凝膠）；（5）磁力懸浮技術。其中自發球體形成和懸滴法的方法是最經濟有效的（如圖16）。
圖16.EC共培養球體測定。a.懸滴球狀體生長試驗隨時間的變化的過程概述。在開始共培養之前，腫瘤細胞（綠色）先建立自己的微球狀體，然后在72小時后引入內皮細胞（紅色），并在14天內監測它們的摻入情況。7天后，腫瘤球細胞球狀體可以通過各種技術進行定量和定性評估，如c（熒光）顯微鏡、組織學、功能分析或植入體內。
(10)內皮細胞代謝實驗
大多數內皮細胞會保持數年的靜息狀態，但在暴露于促血管生成刺激(如VEGF)時，它們可以在健康和疾病狀態下迅速轉換為增殖和遷移狀態。在這種轉換的基礎上，是一個受到嚴格調控的代謝網絡，為內皮細胞做出相應反應提供必要的能量和構建模塊。目前已建立的監測EC代謝活性的方法有:(1)示蹤劑代謝組學，(2)基于放射性示蹤劑的代謝測定，(3)通過海馬XF分析儀測量細胞外酸化率和線粒體呼吸。如圖17。
圖17.用放射性示蹤劑和海馬XF分析儀測定EC代謝。a.用葡萄糖測量糖酵解通量的示意圖。b.改良糖酵解應力試驗的示意圖。c.改進的海馬細胞線粒體應力試驗示意圖。
(11)微流控分析
微流控細胞培養系統的使用改變了我們研究和處理活細胞的方式，許多研究人員利用這些系統來推進和完善我們對血管生成和微血管功能的理解。用于研究血管生成的尖端微流控細胞培養模型已經成功地結合了血管功能定量分析、體外流動室、微制造技術和3D組織支架的原理。因此，微流控方法已經實現了很好地控制化學梯度、流體流動、基質組成和細胞-細胞相互作用水平，所有這些都可以整合起來，為研究血管生成提供生理學相關的背景（如圖18）。
圖18.分析血管生成的PDMS微流控裝置。
(12)流式細胞術和細胞分選分析
癌細胞改變原發部位的微環境，有利于腫瘤的生長和擴散。腫瘤微環境(TME)由許多不同類型的細胞組成。腫瘤血管生成通過提供氧氣和營養物質、細胞因子和生長因子（血管分泌效應），以及傾向轉移的逃逸途徑，促進局部腫瘤的生長和侵襲。在對腫瘤產生的因子的反應中，被招募的CD11b+髓系細胞向另一種激活狀態(M2)極化，而不是經典的激活狀態(M1)。M2極化的CD11b+細胞通過釋放生長和運動因子，包括VEGF、FGF、腫瘤壞死因子(TNF)、血小板源性生長因子(PDGF)和趨化因子，促進腫瘤生長、侵襲、轉移和血管生成。
傳統上，TME是通過組織切片的免疫組織學染色來分析。雖然組織學技術在渲染組織形態方面具有優勢，但它們也有一些相關的局限性：（1）檢測指標有限；（2）染色細胞無法用于進一步分析；（3）對于大量樣本，費時費力；（4）無法對細胞數量和染色信號強度精確定量。而流式細胞術可以規避組織染色的局限性。如圖19所示。
圖19.流式細胞術和細胞分選實驗的代表性流程圖。
(13)雞胚胎的尿囊絨膜實驗（CAM）
盡管Rous 和 Murphy在1911首次報道了雞絨毛尿囊膜(CAM)分析法，以研究哺乳動物腫瘤的異種生長，雞胚胎本身一直是從亞里士多德開始的科學研究的目標。由于受精卵很容易獲得，胚胎也很容易可視化，雞胚胎成為實驗生物學家最喜歡的目標。由于這些優越的性能，CAM不僅廣泛應用于直接的血管生物學研究，還廣泛應用于生物工程、化妝品檢測、移植生物學、藥物和疫苗開發、血管閉塞療法或癌癥研究等。雞胚的絨毛膜尿囊膜實驗如圖20所示。
圖20.雞胚的絨毛膜尿囊膜試驗（CAM）。
更多血管生成相關實驗，請參考文獻“Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays”。