血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳

原 理

以醋酸纖維薄膜為支撐物，浸入pH8.6的緩沖液后吸去多余液體。將微量血清點于膜上，電泳后，將薄膜置染色液中使蛋白質固定并染色，洗去多余染料。

操 作

1．準備與點樣

(1)將薄膜切成2.5×8cm的小片。在薄膜無光澤面(正面)的一端約2cm處用鉛筆劃一線，以標明點樣位置。同時在一端邊沿寫上實驗者的學號或姓名。

(2)將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上(緩沖液盛于培養皿中)，使膜條自然浸濕下沉；

(3)將充分浸透(膜上沒有白色斑痕)的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條兩端各貼于兩塊玻片上使點樣線架空。

(4)用血色素吸管吸取新鮮血清3~5ul，涂于載玻片末端處，或用載玻片在血清上蘸一下，使載玻片下端粘上一薄層血清，然后緊按在薄膜點樣線上，待血清全部透入膜內，移開載玻片。

2．電泳

將點樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時，無光澤面(即點樣面)向下，點樣端置于陰極槽架上以四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙需貼緊，待平衡5分鐘后通電，電壓為110V，電流為0.4~0.6mA/cm，通電1小時左右關閉電源。

3．染色

通電完畢后用鑷子將薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養皿中，反復漂洗數次，直至背景漂凈為止。用濾紙吸干薄膜。

4．定量

本實驗不要求進行定量分析，如有需要，可采用薄層掃描儀進行掃描定量，或采用洗脫后再進行比色的方法進行定量。

5．計算

光密度總和T=A+α1+α2+β+γ

各部分蛋白質的百分數為：

臨床意義

1．正常值： 白蛋白57~72%α1球蛋白2~5%α2球蛋白4~9%

β球蛋白6.5~12%γ球蛋白12~20%

2．肝硬化時白蛋白顯著降低，γ球蛋白升高2~3倍；腎病綜合癥時白蛋白降低，α2和β球蛋白升高。

試劑與器材

1．電泳儀：包括直流電源整流器和電泳槽兩個部分，電泳槽用有機玻璃或塑料等制成。它有兩個電極，用白金絲制成。

2．巴比妥緩沖液，pH8.6，離子強度0.06

巴比妥鈉12.76g，巴比妥1.66g于蒸餾水中加熱溶解后再加水至1000ml

3．氨基黑10B染色液

氨基黑10B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸餾水40ml

4．漂洗液配法

95%乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸餾水50ml 混勻。

注意事項

1．醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白的正常結果不同于紙上電泳，主要是白蛋白偏高，個別正常人白蛋白僅超過70%。α1，α2，和β，γ都偏低，個別正常人γ球蛋白可低到12%左右。上述正常值僅供參考。

2．經電泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95%乙醇(2∶8)溶液中20分鐘，取出后將薄膜平貼于玻璃板上。干燥過程中，薄膜漸變透明。此透明薄膜可用掃描光密度計繪出電泳曲線，并可根據曲線的面積計算各組分的百分數。目前國內已有自動定量的光密度計生產。此透明薄膜可長期保存，供教學示教用。

附：遷移率是膠體顆粒的一個物理常數，可用來鑒定蛋白質等物質以及研究它們的某些理化性質。現將人血漿蛋白質的等電點，遷移率等列于下表，供分析參考。

人血漿蛋白質的等電及遷移率