實驗材料 帶有熒光素酶報道基因并受蛻皮激素誘導表達的質粒帶有感興趣的基因并受蛻皮激素誘導表達的質粒pVgRXR培養的哺乳動物細胞
試劑、試劑盒 新霉素松甾酮 AZeocin培養液
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液稀釋到適當濃度。
新霉素
松甾酮 A
蛻皮激素的另一種類似物是 muristerone A(Sigma 公兩)。
Zeocin
培養液
適合要轉染的細胞生長的培養液
根據不同需要，培養液必須補充 Zeocin、新霉素和松甾酮 A。
附加試劑
本方案步驟 1、2 和 6 需要列在第 16 章適合的轉染方案中的試劑。
本方案步驟 4 需要列在本章方案 6 中的試劑。
本方案步驟 8 需要列在第 6 章方案 8、第 7 章方案 8 或附錄 8 中的試劑。
載體和菌株
帶有熒光素酶報道基因并受蛻皮激素誘導表達的質粒（如 Invitrogen 公司的 pIND 系列）
帶有感興趣的基因并受蛻皮激素誘導表達的質粒
pVgRXR (Invitrogen 公司）
細胞和組織
培養的哺乳動物細胞
方法
1. 用 pVgRXR 穩定轉染細胞，使用適合于所研究細胞的轉染方法（轉染方案的選擇請見第 16 章)。
如果使用 pVgRXR, 就用 Zeocip 篩選帶有該質粒的細胞。對于其他質粒，使用合適的抗生素獲得穩定整合體集落。
2. 為了挑選在有蛻皮激素或其類似物存在時能夠選擇性誘導表達基因的克隆，用攜帶熒光素酶報道基因并受蛻皮激素誘導表達的質粒對步驟 1 中獲得的 Zeocin 抗性集落 (轉染方案的選擇請見第 16 章）進行瞬時轉染。
3. 轉染后 24~96 h, 換上新鮮的含有 Zeocin、新霉素和 5umol/L 松甾酮 A 的培養液, 誘導熒光素酶的表達。細胞在 37°C 和5%~7%CO2 的潮濕培養箱中培養 20 h。
為了最有利于報道分子的誘導表達，松甾酮 A 的量和誘導時間的長短在不同細胞系之間會有變化。為了優化條件，在 0.1~1umol/L 的松甾酮 A 濃度范圍內以及 16~72 h 誘導時間內進行嘗試。