溶液中溶質的濃縮可以從熱力學上通過驅使溶劑變成氣態進人頂部空間 (蒸發) 或煮沸而實現。不幸的是，不穩定的溶質(如蛋白質分子)可以被用于除去溶劑所需的熱量快速降解。由于溶液的沸點是溶液的蒸氣壓等于大氣壓 (頂部空氣壓力） 時的溫度，因此，通過增加溶液的溫度或通過降低大氣壓力 (如采用真空) 都可以使溶劑沸騰。其中后者被稱為真空濃縮 ( v a c u u m concentration)。在冷凍干燥的過程中，樣品的溫度比溶液的凝固點要低 ，溶劑通過升華而被去除。冷凍和真空可同時進行，熱量和頂部的空氣此時被除去，從而對感興趣的產品進行濃縮。將要被冷凍干燥的液態蛋白質產品通常含有生物活性成分 、溶劑體系和幾種膨脹劑及穩定劑。膨脹劑為活性分子提供支撐結構，而穩定劑則在冷凍干燥之前和樣品重新組成之后的液態形式下，對目標蛋白質活性的維持發揮重要的作用 。冷凍干燥一般分為 3 個主要的步驟 （Costantino and Pikal， 2004;Jennings, 1999;Przic et al.， 2004)
（1） 冷凍冷凍速率會影響最終產品的質量。例如，慢速冷凍會導致大冰晶的形成,它會加快冷凍干燥的速率，但可能會使不穩定的蛋白質變性。相反 ，當樣品冷凍快速進行 ，會形成小的冰晶，它會使冷凍干燥速率降低，但卻能保護蛋白質的穩定性。
(2) 初 級 干 燥 在 初 級 干 燥 過 程 中 ，通過升華作用, 大于 8 0 % 的溶劑從固態直接變為氣態。殘留的溶劑以濕氣的形式仍然吸附在產品上。類似于冷凍速率，干燥速率會影響凍干「蛋糕」的結構和形態，所設計的速率要避免樣品融化。
(3)
二 次 干 燥 在二次干燥中，溶
劑殘留的吸附降低到足以抑制微生物生長或化學反應發生的潮濕水平，但同時仍保持了凍干產品的活性和完整性。產品的物理性質決定了二次干燥的可持續時間。例如，蛋白質通常需要殘留水分的存在以維持結構的完整性和生物活性。必要殘余水分的量因產品而異，必須憑經驗而定。
圖 9. 4 總結了冷凍干燥器的主要組成和操作過程。盡管冷凍干燥機的設計因操作規模的不同而有所差異，然而其主要部件和系統需求并沒有改變。過去十年來的創新提高了所有的不同規模冷凍干燥裝置的效率、成本效益、準確性和便利性。這些改進因計算機控制的自動化而被增強。特別是，自動化的樣品裝載/卸載系統通過最大限度地減少用戶的手動操作使這一過程更加精確。增 強 型 實 時 過 程 控 制 和 監 測 的 應 用 ，如 S M A R TFreeze Dryer? Temperature Monitoring 技術（SP Industries， Warminister， P A ) 允許在關鍵的冷凍干燥周期改善溫度控制。例如 ，核磁共振技術 (N M R ) 通過無創的、無接觸的重量檢測技術取代了傳統的稱量技術。
盡管有這些改進，在冷凍干燥過程中固有的局限性依然存在。最困難的挑戰之一是實現特定產品的目標含水量。當殘留溶質-結合水在二次干燥過程中從產品中被去除時，過度干燥會導致產品穩定性降低。未來的冷凍干燥系統將結合精確的監控系統，使用改進的過程質量流量計技術，精確監控冷凍干燥循環中水分的移除。
與當前提高了性能的中試規模的和大型的冷凍干燥器相稱的是，已發展的實驗室規模系統可以處理相對小的樣品體積。 S P Industries 公司、L a b c o n c o 公 司 和 Martin Christ公司專攻實驗室規模系統的開發。新的臺式系統為通過干冰進行冷凍干燥提供了簡單而經濟的設備。例如 ，特殊的系統配備一個中心井用于提供干冰和溶劑，它可以作為水蒸氣收集器和方便的預冷棺。燒瓶、血清瓶和安 瓿 浸 入中心井并在里面旋轉而被凍結。此外，緊湊的臺式冷凍干燥機被設計為具有快速的干燥速率，它無限制的蒸汽通道、更高效的冷凝器以及具有閥門的多出入口復合管路等設計使得其工作效率達到最大。總體而言，當前及未來的實驗室和商用的冷凍干燥器正被設計成包含有微型處理器控制的形式，以減少操作錯誤，最大限度地減少手動操作，提高整體系統的性能。
沉淀是一種常用的純化技術, 用于蛋白質的濃縮和脫鹽。蛋白質沉淀是通過加入某種試劑來改變蛋白質的溶解度，從而將蛋白質從一種溶液中以固體的形式分離的過程。蛋白質沉淀問題將在第 2 0 章中詳細討論。沉淀操作通常成本低廉，易于放大。此外, 大部分沉淀往往在包含有 DNA、脂類和雜質蛋白質的初始料液中進行。有多種方法或系統可用于進行沉淀操作。該項操作的難點是如何確定可完成預期目標的最適方法。沉淀反應可以通過加人中性鹽、有機溶劑、非離子型親水聚合物、多價金屬離子等來誘導，或通過加人酸或堿來進行等電點沉淀（Harrison etal. ， 2003)。影響蛋白質溶解度最重要的因素是結構、大小、電荷和溶劑 (Ladisch, 2007)。一旦蛋白質沉淀, 便可以將之通過隨后的離心或過濾從溶液中分離。沉淀可以重新溶解到較小體積的溶液中從而達到蛋白質的濃縮 ，或經洗滌并重新溶解到新溶液中以改變溶液的條件。
有
許 多 市 售 的 濾 板 或 管 可 以 以 9 6 孔 板 的 形 式 使 用（A n a c h e m ， U K ;
MilHpore，Bedford, M A ; Pall, M e r i d e n, C T ),
它們的使用可以實現以最小量的資源來篩選沉淀條
件
。這些板也可以使沉淀技術自動化，進一步節省了資源。市售的結晶篩選試劑盒內含有能反映蛋白質潛在沉淀/結晶條件的即用型溶液，對探索寬范圍的緩沖液、p
H 和沉淀劑也非常有用 （H a m p t o n Research, Aliso Viejo, C A ; Sig m
a-Aldrich, S t L o u i s ， M O
)。許多沉淀方法，包括使用有機溶劑的沉淀和等電點沉淀，可能會導致蛋白質變性或生物活性降低。雖然有損于蛋白質的功能，但這些沉淀方法通常還是被用于去除包含在生物制品溶液中的那些會干擾下游應用和分析的組分。一些分析技術通常采用變性的蛋白質
，不需要蛋白質具有生物學活性和其他功能。例 如 ，將蛋白質變性是 SD&
PAGE分析方法的一部分。對于這些應用，可將蛋白質變性的沉淀方法仍然適用 。 一 些常用的沉淀
劑用于樣品分析前蛋白質的濃縮和干擾物的消除，包括乙醇、丙酮、氯仿/甲醇、TCA 等 。
使用丙酮進行蛋白質沉淀可以通過向蛋白質樣品中加入
4 : 1 的冷丙酮（一 20°C )
來完成。然后進行混合、離心，并將上清液丟棄。這一過程可以重復以更好地去除鹽類和其他雜質。隨后將沉淀物干燥并重溶于目標緩沖液中。一個類似的操作是將
9 : 1 體積的冷乙醇 (-20°C) 加人到蛋白質樣品中。使用乙醇的一個優點是它的易燃性小于丙酮。 Wessel和 Flugge
(1984)提出了一個氯仿-甲醇沉淀系統, 提高了對稀蛋白質溶液的回收率。TCA
沉淀法被認為是一種將蛋白質從稀溶液中沉淀的非常有效的方法。向蛋白質樣品中加人同等體積的 2 0 % TCA，冰 浴 30 min。 4°C
離心，棄去上清液。然后將片狀沉淀物用冰丙酮 (一 20°C) 洗滌，4°C 再次離心, 棄上清液，干燥。沉淀物可以用目標緩沖液溶解
。可能需要額外的丙酮洗滌或中和重新溶解的樣品，以降低酸度，有利于進一步的分析
操作 。 Svaraman 等 (1997) 證 明 在 TC A 濃 度 為 1 5 % 左右時進行蛋白質沉淀效果最佳。
在許多情況下，實驗者希望在沉淀操作后蛋白質的活性和結構仍可以保留。該目標可以通過向蛋白質樣品中加入中性鹽(鹽析) 或親水性非離子型聚合物 (如聚乙二醇) 來實現 。 Hofmeister (1887;1890) 首先描述了使用中性鹽沉淀蛋白質的方法。最常用的鹽是硫酸銨，因為它水溶性極高, 并對蛋白質的生物活性無有害作用。硫酸銨沉淀通常是通過緩慢地將飽和硫酸銨溶液 (41. 22 g/100 g 水 ,25 °C ) 加人到蛋白質樣品中以達到所需要的濃度來完成。不同的蛋白質在硫酸銨中的溶解度有很大的差異，所以 ，通過預實驗來確定目標蛋白質從溶液中沉淀時硫酸銨的濃度可能是非常有益的。蛋白質的這一特性使得將一種蛋白質從其他蛋白質和污染物中通過分步沉淀而進行純化的設想成為可能。親水聚合物, 如聚乙二醇 (PEG) 也可以用于沉淀蛋白質而同時保留蛋白質生物活性。使用相對分子質量大于 4000 的聚乙二醇更易于進行蛋白質的沉淀。 Atha 和 Ingham (1981) 論證了使用濃度為 3% ?30% (w /V )的 PEG 4000 對幾種蛋白質的沉淀情況。
結晶是另一種純化技術，它類似于沉淀作用，可用于蛋白質的濃縮和脫鹽。蛋白質結晶是一個強大的分離技術，因為它可同時濃縮、純化和穩定蛋白質產品 (Etzel， 2006)。結晶是一種在水溶液中受控制的沉淀，主要 有 4 個變量可用來控制結晶的形態和回收: 蛋白質的濃度、沉淀劑的濃度、pH 及溫度。結晶類似于沉淀，都是從溶液中形成固體顆粒; 但沉淀具有不確定的形態，呈現出小顆粒特征，而結晶是髙度有序的，通常呈現出較大的顆粒 。多孔板和小型化的高通量篩選系統正被開發，它們與自動化液體處理方法及新型的分析方法相結合，使得對納升 (nanoliter) 級樣品進行寬范圍結晶條件的快速篩選成為可能 (Brown et a l,， 2003)。 此 外 ，微流體芯片的應用已被發展用于生物分子的結晶（Tera-genics, Watertown, M A)。 實際上，對一個蛋白質進行結晶比對其沉淀往往更加困難，為了進行蛋白質的濃縮和脫鹽，沉淀往往是一種更常用的辦法。此外，當結晶過程被從實驗室水平放大時，混合的力度可顯著影響晶體的穩固性。