【實驗原理】
Western
Blot（蛋白質印跡或免疫印跡）技術，以蛋白質為檢測對象，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將樣品蛋白質分離，再轉移到固相載體（PVDF尼龍膜或NC膜）上；固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變；然后以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與其對應的抗體（一抗）發生免疫反應，特異性一抗再與和酶耦聯的第二抗體反應，最后在酶的作用下，導致底物顯色或化學發光顯影，來檢測電泳分離的特異性目的靶蛋白。
蛋白質印跡技術結合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異性高、敏感等諸多優點，能從復雜混合物中對特定抗原進行鑒別和定量檢測。
【實驗對象】
待測蛋白質或基因表達產物。
【試劑與器材】
1.SDS-PAGE試劑(見SDS-PAGEelectrophoresis.htm%5C%22>http%3A%2F%2Fshiyan.ebioe.com%2FSDS-PAGEelectrophoresis.htm)。
2.勻漿緩沖液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3.固相載體：PVDF尼龍膜或NC膜（硝酸纖維素薄膜）。
4.轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml (48mmol/L Tris.HCl，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS)。
5.PBS-T(pH7.4)： 0.01mol/L PBS（NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO40.24g）；1g吐溫20，加ddH2O至1000ml。
6.膜染色液：考馬斯亮藍 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O 118ml。
7.封閉液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01mol/L PBS中。
8.顯色液：化學發光劑（ECL）或DAB 6.0mg，0.01mol/L PBS 10.0ml，硫酸鎳胺0.1ml；H2O2 1.0μl。
9.電泳儀，搖床等。
【實驗方法與步驟】
基本方法：①將待檢測樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離各組分。②
通過印跡技術把分離樣品原位、定量轉移到NC膜上。③
用特異抗體與NC膜上的靶抗原反應，結合上的抗體（一抗）再與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯的抗免疫球蛋白（二抗）進行反應（此步驟類似間接ELISA
法測抗原的反應）。④最后通過酶與底物作用，產生發光或顯色反應來檢測靶抗原。實際操作時，常把印跡后的NC膜分成兩部分，一部分如上所述做免疫檢測，另一部分直接進行蛋白質染色，以便對轉移情況做直接觀察和判斷待測抗原所處位置，并推算其分子量。具體操作步驟如下：
1． 蛋白質樣品的制備與SDS-PAGE分離
（１）蛋白質樣品獲得 ①細菌誘導表達后，樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解；②哺乳動物組織通常可機械分散（機械或超聲波室溫勻漿0.5～1min）并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液，然后4℃，13
000g離心15min，取上清液作為樣品；③組織培養的單層細胞可用勻漿緩沖液裂解，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解；制備好的樣品用做SDS-
PAGE分析。
（２）電泳 按常規方法進行SDS-PAGE（(見第二十五章 第一節)。
2． 蛋白質從凝膠轉移到NC膜上（半干式轉移）
（１）平衡凝膠：用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。
（２）膜處理: 將濾紙和NC膜，一同在轉膜緩沖液中浸泡10min。
（３）轉膜：①轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、3層厚濾紙、PVDF尼龍膜、凝膠、3層厚濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、PVDF尼龍膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。②用支架夾緊上述各層，置電轉移槽中，NC膜一側靠正極，凝膠一側靠負極。接通電源，40V、約1.5A轉移1.5～6h。轉移時間長短依靶蛋白分子量大小來調節。③轉移結束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡。④將有蛋白Marker的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。