蛋白質免疫印跡技術

實驗概要

免疫印跡是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測樣品或提取物中某種特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝膠緊貼著膜放置，在電流的作用下蛋白質從凝膠遷移到膜上并且被固定，常用的膜是硝酸纖維素或 PVDF（聚偏乙烯氟化物）。膜是凝膠蛋白質的復制品，然后可以與抗體結合后進行染色。

實驗步驟

1.   樣品準備

1)   抽提緩沖液
準備凝膠電泳的樣品，需要對細胞和組織進行抽提以釋放目標蛋白，這些可溶性蛋白能夠穿過分離膠單獨移動。抽提緩沖液有很多種，但用來做 WB 試驗的僅有少數幾種。簡單來說，它們溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸鈉和其他離子型去污劑的溶解能力最強。

但部分 Abcam 抗體能夠識別降解和變性蛋白質，因此應該在還原和變性條件下使用該類抗體。需要注意的是一些抗體只能識別天然的、非變性的蛋白質，故不能識別經去污劑（SDS、脫氧膽酸鹽、弱降解作用的 Triton X-100 和 NP-40）作用的蛋白質。

選擇抽提緩沖液首先要考慮選擇的抗體是否識別變性的樣品。如果不能，有關資料會列在抗體說明書上，應該使用不含去污劑的緩沖液或者是相對溫和的非離子型緩沖液（NP-40，Triton X-100）。

2)   蛋白酶和磷酸酶抑制劑

一旦裂解發生，水解、去磷酸化和變性就開始了。如果樣本一直保存在冰上或 4 °C，并且一開始就往抽提液中加入適當抑制劑的話，這些反應將可以大大減緩。

混合（雞尾酒）的蛋白酶和磷酸酶抑制劑已經商品化，您也可以自己研制抑制劑的配比。

3)   細胞培養物的裂解準備

        a. 用雙蒸水溶解原釩酸鈉至 100 mM。

        b. 用鹽酸調 pH 值至 9.0。

        c. 加熱至無色。為盡量減少由于蒸發所致體積減小，加熱時加蓋。

        d. 冷卻至室溫。

        e. 調 pH 值至 9.0。

        f. 再次加熱至無色。

        g. 再次加熱冷卻重復以上循環直至加熱冷卻后溶液 pH 值保持在 9.0。

        h. 用水補至起始體積

         i. -20 °C 分裝保存，若變黃則廢棄。

4)   組織抽提準備

        a. 將細胞培養皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗滌細胞。

        b.  吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每 10⁷ cells/100 mm² 培養皿/150 cm²培養瓶加 1 ml，0.5 ml 每 5 x 10⁶ cells/60 mm²培養皿或 75 cm²培養瓶加 1 ml）。

        c. 用預冷的塑料細胞刮刀將貼壁細胞從培養皿上刮下，然后輕輕將細胞懸液轉移到預冷的小離心管中。

        d. 4 °C 持續振蕩 30 分鐘。

        e. 4 °C 預冷微型離心機中 16000g 離心 20 分鐘。

        f. 從離心機中輕輕地取出離心管放置在冰上。將上清液吸出轉移到預冷的新管（放在冰上）中，棄沉淀。

5)   蛋白質含量的測定

用 Bradford、Lowry 或 BCA 方法測定蛋白質含量，牛血清白蛋白是常用的蛋白標準。

一旦確定了每管的蛋白濃度，就可以在 -20 °C 或 -80 °C 冷凍樣品備用，或為免疫沉淀反應或凝膠上樣做準備.

6)   凝膠上樣準備

抗體特異性識別目的蛋白的部位（即抗原表位）可能存在于蛋白的三維構型內部。為了能使抗體接近抗原表位，必須將蛋白的三維構型打開，即變性。

要使蛋白質變性，使用含陰離子變性去污劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的上樣緩沖液，95-100 °C 煮沸 5 分鐘。或者在 70 °C 加熱 5-10 分鐘，尤其是研究跨膜蛋白時，因為煮沸更易形成聚集物，而聚集物不能有效的進入膠中。

標準品上樣緩沖液稱做  2 倍 Laemmli 緩沖液，最初描述在《自然》雜志上（1970 Aug 15; 227(5259):680 -5.）。也可以用 4 倍和 6  倍的樣品緩沖液，可以減少緩沖液對樣品的稀釋。2 倍的樣品緩沖液和樣品以 1:1 的比例混合。

使用  SDS，通過 SDS 陰離子的粘附作用，所有的蛋白質都帶負電荷，SDS 通過“纏繞”多肽鏈使蛋白變性。SDS 以 1.4:1  的比例結合到蛋白上，SDS  賦予多肽的負電荷數與蛋白的長度成比例，即變性的多肽成為負電荷云的“標”，每一單位長度的多肽帶有相同的電荷數或電荷云密度。

在變性 SDS-PAGE 中，遷移率不是由多肽固有的電荷數目來決定，而是由多肽的分子量來決定。SDS 的純度尤為重要，低純度的或放置時間較長的 SDS 可引致不明顯的蛋白條帶和高背景。

使用 SDS，通過加入 β 巰基乙醇或二硫蘇糖醇 (DTT)，在蛋白形成自由彎曲之前減少二硫鍵的形成是非常必要的，使蛋白可按分子量大小來分離。

上樣緩沖液中加入甘油能增加樣品的密度，使樣品停留在樣品池的底部，防止外溢和使凝膠上樣不規則。

為了能看到蛋白的遷移，通常在上樣緩沖液中加入小分子的離子型染料（如溴酚藍）。染料在混合物中的遷移速度最快，能夠提供一個遷移前沿來監測分離的過程。

蛋白質樣品處理時，加熱前后都要用漩渦振蕩器徹底混勻樣品，使溶解徹底。

2.   電泳

1)   PAGE 凝膠準備

聚丙烯酰胺凝膠電泳, 英文簡稱是 SDS-PAGE (for Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Eletrophoresis)，是根據蛋白質分子量來分離蛋白質的基本方法。

聚丙烯酰胺凝膠由兩種化合物聚合而成，丙烯酰胺和 N,N-亞甲基丙烯酰胺（縮寫為 Bis）。Bis 是凝膠的交聯劑。通過加入過硫酸銨和 DMAP 或 TEMED 啟動交聯聚合作用。凝膠為中性、水溶性三維網狀結構。（通過亞甲基交聯的碳氫化合物）。

分子在凝膠中的分離取決于凝膠內部所形成的孔徑大小。凝膠孔徑的大小由兩個因素決定：丙烯酰胺的總量（表示為  %T）和交聯度 (%C)，當丙烯酰胺的百分含量升高，孔徑減小。5%C 時孔徑最小。C%  增加或減少，孔徑也隨之增大或減少。凝膠的百分比濃度組成有二個重要的參數。總丙烯酰胺指的是丙烯酰胺占 bis-丙烯酰胺總量的百分比濃度  (w/v)。例如，7.5%T 表示 100ml 凝膠中有 7.5 g 丙烯酰胺和 bis。

2)   陽性對照

陽性對照抽提物用來檢驗實驗體系的有效性和正確性，及可證明目標蛋白不在樣本中表達。

3)   分子量 marker

樣品旁邊的分子量標準能標示蛋白分子量的大小并能監測電泳的過程。有許多市售分子量標準可供選擇。

4)   上樣和跑膠

使用特定的凝膠上樣吸頭或微型注射器在狹窄的樣品池中加入全部樣品，注意不要用尖頭刺破池的底部，否則會形成扭曲的條帶。不要過度填充樣品池，如果樣品溢入旁邊的樣品池，將會影響結果。每個樣品池裝載  20-40 μg 蛋白。將凝膠浸泡在電泳緩沖液中，除了天然的凝膠電泳緩沖液外通常包含 SDS。

一個標準的  PAGE 電泳緩沖液，又叫運行 (running) 緩沖液，是 1 ×  氨基乙酸-甘氨酸。凝膠電泳時按照廠家推薦的時間進行，這些可以隨著儀器的改變而改變（根據電壓，1  小時至過夜）。當染料分子（遷移前沿）到達凝膠的底部，關閉電源。此時蛋白會從凝膠上慢慢的洗脫，不要保存在凝膠里，因此要迅速進行下一步的轉移操作。

5)   使用對照

內參是用來檢測所有的電泳道載有相同樣本量。在比較不同樣品的蛋白表達水平時這一點尤其重要。這對檢查整個凝膠的平均轉膜非常重要。如有上樣或轉膜不平均的情況，內參對照用來定量每條泳道的蛋白量。

3.   蛋白質的轉移和染色

1)   蛋白在凝膠中的顯色

此階段的蛋白顯色非常重要，可以知道蛋白遷移的是否均勻、平坦。如果分離后的蛋白需要轉膜，就用銅染，因為考馬斯藍染色是不可逆的。轉移后用考馬斯藍染色檢測轉移的有效性，或者不需要轉膜僅僅觀察蛋白 SDS-PAGE 分離的結果時用考馬斯亮藍染色。

2)   轉移

        a. 詳細的轉膜操作可以在電轉儀廠家的網頁上找到，不同的系統操作也有區別。蛋白從凝膠至膜的轉移應用的原理是電荷在電場中的遷移。

         b. 轉膜方式分為半干轉移和濕轉移兩種，半干式轉膜速度比較快，而濕式轉膜不會因為膜的干燥而失敗，因此成功率高并特別適合分子量大于 100  kDa 的蛋白。兩種轉膜方式都是膜緊貼凝膠，位于兩層吸收材料之間，固體夾板夾在外面以保證膜和凝膠的緊密接觸。

          c. 濕式轉膜中膜和凝膠的三明治結構位于濾紙和海綿體之間（海綿/紙/膠/膜/紙/海綿），全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡。整個三明治結構浸泡在轉移緩沖液中，然后施加電場。帶負電荷的蛋白向陽極移動。但膜阻擋了它們，并與其進行結合，從而阻止了它們的繼續移動。凝膠一般在  100V 條件下運行 1~2 小時，但時間和電壓需要優化，我們推薦根據廠家的說明進行操作。

        d. 標準的濕轉緩沖液和電泳緩沖液一樣，為不含 SDS 的 1X Tris-gly 緩沖液，加入終濃度 20% 甲醇。如果轉膜的蛋白分子量大于 80 kDa，則推薦加入 SDS 使之終濃度為 0.1%。

          e. 半干式轉膜中，三明治結構紙/凝膠/膜/紙用轉移緩沖液浸濕，直接置于電轉儀的正負極之間。在進行轉移時，要注意一定要使膜緊貼陽極而膠緊貼陰極。電轉緩沖液中  Tris 和甘氨酸的比例不必和濕轉的相同，參考廠家的儀器說明書。標準配方是：48 mM Tris、39 mM 甘氨酸、0.04%  SDS、20% 甲醇。

         f. 兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和 PVDF 膜（帶正電荷的尼龍膜）。PVDF 膜需要小心地進行前處理：剪出大小合適的膜，在甲醇中浸泡  1-2 分鐘，再于冰冷的電轉緩沖液中孵育 5 分鐘。膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡 3-5 分鐘，否則轉膜時起皺導致條帶變形。

3)   蛋白在膜上的顯色：麗春紅

為檢測轉膜是否成功，用 TBST 溶液洗膜（TBST 溶液的配制詳見 77 頁緩沖液章節）。準備貯備液：2% 麗春紅 S 溶于 30% 三氯乙酸和30% 磺基水楊酸，室溫條件下震搖 5 分鐘。1:10 稀釋貯備液。

然后將膜浸泡在水中直至水變清且蛋白條帶清晰。

用 TBST 溶液或水重復洗膜直至膜完全脫色，PVDF 膜需再用甲醇活化然后用 TBST 溶液洗。

4)   膜封閉

有兩種傳統封閉液：脫脂奶粉或 BSA（Cohn 因子  V），脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結合磷酸化特異性抗體而易產生高背景）。為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結合，需要進行膜的封閉。

某些抗體用 BSA 封閉時可能會產生比脫脂奶粉更強的信號，參考數據表的說明，以確定有無關于如何封閉膜的特殊指導。

用封閉緩沖液封閉 1 小時，4 °C 震搖，封閉后用 TBST 溶液洗 5 秒

5)   加一抗孵育

孵育緩沖液：按抗體說明書建議的稀釋倍數，用 TBST 溶液稀釋一抗。如果說明書沒有建議稀釋倍數，則參照一般推薦的稀釋倍數(1:100-1:3000) 進行預試驗，然后根據試驗結果選擇合適稀釋倍數，一抗濃度過高會導致產生非特異性條帶。

某些實驗室傳統上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的 TBST 來孵育抗體，結果因抗體而異，有時兩者結果相同，有時結果不同。

孵育時間：一抗的孵育時間可從幾小時至過夜（一般不超過 18 小時）不等，具體取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數和較長的孵育時間來保證特異性結合。

孵育溫度：如果在封閉液中孵育過夜，應在 4 °C 進行。否則污染會導致蛋白降解（特別是磷酸基團）。孵育一抗時需保持適當的搖動使之均勻覆蓋膜，防止結合不均勻。

6)   加二抗孵育

一抗孵育結束后，用 TBST 搖動洗膜數次，每次 5 分鐘或更長，去除殘留的一抗。

孵育緩沖液和稀釋：按說明書推薦的倍數用 TBST 稀釋二抗，如果說明書沒有標出稀釋倍數，則按常規的倍數稀釋 (1:1000-1:20,000) 預實驗，二抗的濃度過高也會導致非特異性條帶。

可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景的同時導致特異性條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與目標蛋白的結合。  

孵育時間和溫度：室溫振蕩 1-2 小時。

標記物：推薦使用 HRP 標記二抗，不建議使用 ALP（堿性磷酸酶）標記二抗，因其不夠靈敏

7)   檢測方法

檢測試劑盒：

HRP 標記二抗：常規應用 ECL 和 ECL （自制或購買），推薦使用后者。對于新一代檢測儀器例如 Genegnome，請用儀器制造商推薦的試劑盒。

我們不推薦 ECL 或 BCIP/NBT 試劑盒，因為不夠靈敏。

X-ray 膠片：

通常采用手工曝光的方法，可控制 X-ray 膠片在曝光劑和定影劑的時間。而全自動 X-ray 膠片曝光器也已經廣泛使用且操作簡便。

數字圖像顯影：

新一代的膠片顯色方法是使用數碼相機在暗室中拍攝膜上的化學發光，將其轉成數字信號，再通過儀器自帶的軟件進行分析。

已有市售的數字成像儀。新一代數字成像儀不使用 HRP 標記抗體（即化學發光），如 STORM 分析儀只檢測熒光標記二抗，Odyssey 紅外線成像系統則只能檢測紅外線熒光。