自從發現蛋白酶在生物調控過程中的重要作用后，又可按其生理功能及其專一性來分類。
非限制性水解蛋白酶
是指酶的專一性很差，能水解蛋白質中的很多肽鍵，使生成各種小肽甚至游離氨基酸。這類蛋白酶的生理功能主要是參與體內蛋白質的降解作用，例如胃腸道系統所分泌的各種蛋白酶將體外攝入的食物蛋白消化分解；細胞溶酶體內各種組織蛋白酶能清除體內各種代謝產物。平均壽命為 120天的紅細胞，其血紅蛋白即由組織蛋白酶所降解。
限制性水解蛋白酶
是指酶的專一性很強，只作用于某一特定的蛋白質底物，水解其中特定的肽鍵，并隨之產生各種具有不同生理功能的活性多肽或蛋白質。這類蛋白酶在體內即起生物調控作用，它們大多屬于絲氨酸蛋白酶，從其專一性來看類似于胰蛋白酶，即只作用于精氨酸或賴氨酸的羧基端所組成的肽鍵。這些蛋白酶和一般的蛋白酶不同，對常見的蛋白質如酪蛋白或血紅蛋白的降解活力很低甚至不起作用，即使對其專一水解的蛋白底物，在構象上也有嚴格要求，底物一旦變性就不能被它降解，而非限制性水解的蛋白酶卻相反，蛋白底物變性程度愈大愈易水解。例如凝血酶在使纖維蛋白原激活時,在150個精氨酸或賴氨酸殘基的肽鍵中只水解纖維蛋白原α、β兩亞基N 端附近的精-甘肽鍵，釋放出血纖維肽A、B，從而使可溶性的血纖維蛋白原轉變成凝膠網狀的血纖維蛋白。