葡萄球菌屬細菌的微生物學檢驗

葡萄球菌屬細菌的微生物學檢驗:一、生物學特性葡萄球菌是革蘭陽性球菌，大小0．5～1．5μm ，呈單、雙、四聯、短鏈狀或無規則葡萄狀排列。無動力、無芽胞。其代謝方式是呼吸兼發酵。觸酶陽性。通常氧化酶陰性，還原硝酸鹽，能被溶葡萄球菌素溶菌，但不被溶菌酶溶菌。能利用多種碳水化合物，產酸。產生胞外酶，如葡萄球菌血漿凝固酶。多數菌為兼性厭氧菌，有氧條件下生長好，最適生長溫度35 ℃～40 ℃，最適p H7．0～7．5 。金黃色葡萄

一、生物學特性

葡萄球菌是革蘭陽性球菌，大小0．5～1．5μm ，呈單、雙、四聯、短鏈狀或無規則葡萄狀排列。無動力、無芽胞。其代謝方式是呼吸兼發酵。觸酶陽性。通常氧化酶陰性，還原硝酸鹽，能被溶葡萄球菌素溶菌，但不被溶菌酶溶菌。能利用多種碳水化合物，產酸。產生胞外酶，如葡萄球菌血漿凝固酶。多數菌為兼性厭氧菌，有氧條件下生長好，最適生長溫度35 ℃～40 ℃，最適p H7．0～7．5 。金黃色葡萄球菌某些少見菌株，亦需要CO₂ 或血紅素、維生素K等物質。葡萄球菌細胞壁缺陷型菌株適宜在高滲環境中生長。DNA 中G＋C含量：30～39 mol％。模式菌：金黃色葡萄球菌。

二、微生物學檢驗

1．檢驗程序

2．標本采集

由于該屬細菌對干燥和溫度抵抗力強，且易從感染部位獲取標本，故按常規方法采取標本。然而該屬細菌廣泛分布在人體皮膚和粘膜， 采取時避免病灶周圍正常菌群污染。

3．標本直接檢查

無菌體液如腦脊液和關節穿刺液可使用涂片、革蘭染色、直接顯微鏡檢查，查見細菌具有重要臨床價值，其他體液標本如同時伴有炎性細胞時則直接顯微鏡檢查結果也具有參考價值。涂片檢查發現有革蘭陽性球菌，則可向臨床發生初步報告“查見類似葡萄球菌屬革蘭陽性球菌”，并進一步用培養法和合適的鑒定技術予以證實。

4．分離培養與藥學招聘鑒定

臨床標本可接種于血瓊脂平板，那些有污染的標本如糞便等應接種在選擇平板上，如甘露醇高鹽平板、哥倫比亞多粘菌素奈啶酸平板，血液標本則用肉湯增菌培養基。孵育過夜平板上可見直徑約為2～3 mm，呈金黃色、白色或檸檬色的光滑、不透明、凸起圓形菌落，有時可見β溶血環。挑取菌落作鑒定試驗，在鑒定結果報告以前， 平板應繼續室溫放置2 ～3 天，觀察菌落性狀，有助于菌種鑒定。

細菌鑒定方法如下：

（1)菌落性狀。血瓊脂平板孵育24h 后，菌落直徑1～3 mm ，培養物繼續置室溫生長，2 ～3 天后不同種葡萄球菌菌落性狀如下所述：

a．金黃色葡萄球菌：較大，直徑為6～8 mm，光滑、完整、稍隆起，半透明，金黃色色素或橙色。

b．表皮葡萄球菌：較小，直徑為5～6 mm ， 某些產粘液菌株能粘附在瓊脂平板表面，無色素或白色色素。

c．溶血葡萄球菌：5～9 mm，光滑奶酪狀，不透明，無色素或奶油色、黃色。

d．里昂葡萄球菌：4～7 mm，邊緣整齊稍扁，奶色、黃色色素和沃氏葡萄球菌相似。

e．腐生葡萄球菌：5～8 mm 邊緣整齊，光滑，不透明，凸起，白色或擰檬樣色素。疑為葡萄球菌屬細菌菌落以革蘭染色證實為陽性球菌，以與酵母菌區別。

（2)凝固酶試驗。是廣泛應用于鑒定引起急性感染的病原性葡萄球菌的一種試驗。有玻片法和試管法兩種。該試驗所使用的血漿為EDTA抗凝兔血漿。

a．玻片凝固酶試驗：金黃色葡萄球菌表面有結合的凝固酶（聚集因子)，與血漿中的纖維蛋白原交聯使菌體快速凝聚。試驗時挑取少數菌落培養物（不能用生長于高鹽瓊脂上的菌落) 加入一滴血漿，10秒內觀察細菌聚集和凝塊形成。金黃色葡萄球菌、中間型葡萄球菌呈現陽性反應。

b．試管凝固酶試驗：細菌分泌到菌體外的凝固酶被血漿中的協同因子（cofactor)激活形成復合物，再使纖維蛋白原轉變成纖維蛋白。試驗時，以孵育過夜的牛心腦浸液肉湯培養物和血漿在37 ℃水浴中孵育4h，觀察凝塊形成。如試驗結果為陰性者再置室溫18～24h ，因某些菌種（中間葡萄球菌、豬葡萄球菌) 的凝集出現所需時間長4h 。但必須注意：

① 某些菌株產生的葡激酶在延長孵育時間后可使凝塊溶解使之產生假陰性；

② 若使用不是無菌血漿可產生假陽性或假陰性結果；

③ 細菌不是純培養物或污染可導致假陽性。

c．其他凝固酶試驗：尚有商品化膠乳凝集試驗和間接血凝試驗檢測凝固酶。膠乳凝集試驗較一般的玻片法的特異性和敏感度高。

另外有一種新型的玻片試管法試驗， 先將凍干的兔血漿置人反應管中， 
 

用前復溶，混人數個菌落，1 分數時懸液凝聚者為陽性，仍為懸液者為陰性。再將陰性反應管再經35 ℃溫育5 小時，觀察是否凝固以判斷是否存在游離凝固酶。

（3)耐熱核酸酶試驗。大多數金黃色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中間葡萄球菌、豬葡萄球菌能產生耐熱核酸酶。將待測菌的過夜肉湯培養物置沸水浴15min 后， 滴加于含甲苯胺藍核酸瓊脂上已打好的直徑為2～5 mm 小孔內，置35 ℃ 孵育，1h 后觀察結果，環繞孔周圍藍色瓊脂轉變為粉紅為陽性。此外表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、肉葡萄球菌含微弱耐熱核酸酶。

（4)磷酸酶試驗。大多數的表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中間葡萄球菌和豬葡萄球菌，該試驗陽性。將待測菌種點種在加有硝基酚磷酸鹽的p H5．6 ～6．8 M H 瓊脂上，孵育18 ～24h ，菌落周圍出現黃色為陽性。

（5)吡咯烷酮芳基酰胺酶試驗。溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌和中間葡萄球菌為試驗陽性。將孵育24 小時斜面培養物接種在含吡咯烷酮－β萘基酰胺（PY R) 肉湯中，使細菌濃度為2 號麥氏管濁度，35 ℃ 孵育2小時，加入PYR試劑后2分鐘內呈現深紫紅色為陽性。

（6)其他鑒定試驗。鳥氨酸脫羧酶試驗、脲酶試驗、β－半乳糖苷酶、3－羥基丁酮酸試驗、新生霉素敏感試驗、多粘菌素B 耐藥試驗、糖產酸試驗是常用的葡萄球菌屬種間細菌的鑒定生化試驗。臨床上常見葡萄球菌菌種的鑒別見下表。商品化鑒定系統多應用糖發酵、傳統的鑒定試驗以及酶的產色底物試驗，常用的有API 、Staph－ID 系統、APIstaph 系統，ID32staph 系統、uiten 革蘭陽性鑒定卡、Microscan系統、Miniten 系統等。

5．藥物敏感性試驗

葡萄球菌屬細菌藥敏試驗選擇抗生素：A 組（常規首選藥物) 為苯唑西林、青霉素；組（臨床使用主要藥物) 阿齊霉素、克林霉素、甲氨芐啶／磺胺甲口惡唑、萬古霉素；C 組（對A 組耐受、過敏或無反應者) 選用環丙沙星、慶大霉素、氯霉素；U 組（尿道中分離的細菌) 用諾氟沙星、呋喃妥因。

通過藥敏試驗可篩選出耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistant Staphylococcus ，M RS)，它是攜帶mecA 基因、編碼低親和力青霉索結合蛋白導致耐甲氧西林、所有頭孢菌素、碳青霉烯類、青霉素類＋青霉素酶抑制劑抗生素的葡萄球菌，該菌是醫院內感染的重要病原菌，感染多發生于免疫缺陷患者、老弱患者及手術、燒傷后的患者、極易導致感染暴發流行，治療困難、病死率高。

6．其他

尚可用ELISA 或對流免疫電泳方法檢測金黃色葡萄球菌磷壁酸抗體；用脈沖凝膠電泳法對葡萄球菌的質粒和染色體進行限制性內切酶圖譜分析等非培養方法的檢測。

7．檢驗結果分析與醫學全在線報告

葡萄球菌是臨床上常見的細菌， 經涂片染色鏡檢觀察革蘭陽性球菌和典型菌落形態，若觸酶試驗陽性者，應先用凝固酶試驗檢查，將其分成凝固酶陽性和凝固酶陰性細菌。前者大多為金黃色葡萄球菌，應及時快速鑒定和進行藥敏試驗，盡快報告臨床。后者大多是從輸液導管、人工植入組織中分離出的細菌，應視為病原菌，須鑒定到菌種。對凝固酶陰性葡萄球菌，可先用呋喃唑酮紙片（100μg／片)，桿菌肽紙片0．04u／片作藥敏試驗和氧化酶試驗，以此與微球菌屬細菌鑒別，微球菌對桿菌肽敏感而對呋喃唑酮耐藥、氧化酶試驗陽性，與葡萄球菌屬正好相反。若藥物敏感性試驗是用氧西林耐藥的菌株，則報告該菌株耐所有青霉素、頭孢菌素、碳青霉烯類和β－內酰胺藥β－ 內酰胺酶抑制劑類抗生素，同時對氨基糖苷類，大環內酯類和四環素類抗生素也耐藥。

三、臨床意義

凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌是人類重要致病菌，可引起社區和醫院感染。感染常以急性、化膿性為特征，如果未經治療，感染可擴散至周圍組織或經菌血癥轉移至其他器官。常見的感染有癤、癰、外科切口、創傷等局部化膿性感染和骨髓炎、化膿性關節炎、肺炎、心內膜炎、腦膜炎等全身性感染。金黃色葡萄球菌的致病性主要與各種侵襲性酶類（如血漿凝固酶、透明質酸酶、磷脂酶、觸酶、耐熱核酸酶)
 

和多種毒素（溶血毒素、殺白細胞素等) 有關。某些菌株產生的腸毒素可引起食物中毒，表現為急性胃腸炎。噬菌體Ⅱ組金黃色葡萄球菌產生的剝脫毒素（或稱表皮溶解素) 可引起人類燙傷樣皮膚綜合征，多見于新生兒、幼兒和免疫功能低下的成人。患者皮膚呈彌漫行紅癍和水皰形成，繼以表皮上層大量脫落。由噬菌體Ⅱ型金黃色葡萄球菌產生的毒性休克綜合征毒素－1（toxic chock syndrome toxin1，TSST－1)， 引起機體發熱并增加對內毒素的敏感性，該毒素屬超抗原家族，刺激T 細胞誘發TN F 和LI－1，可致機體多個器官系統的功能紊亂或引起毒性休克綜合征（TSS)。

凝固酶陰性葡萄球菌是人體皮膚粘膜正常菌群之一，是醫院感染的主要病原菌，其中表皮葡萄球菌引起人工瓣膜性心內膜炎、靜脈導管感染、腹膜透析性腹膜炎、血管移植物感染和人工關節感染等；腐生葡萄球菌則是女性尿路感染的重要病原菌，其他凝固酶陰性葡萄球菌也已成為重要的條件致病菌和免疫受損患者的感染菌。感染的發生常和細菌產生夾膜多糖或糖萼有關，它增強細菌與藥學招聘外來物質（生物性瓣膜、導管等) 表面的粘附或在其表面形成一層生物膜而保護細菌對抗殺菌物質作用。葡萄球菌的耐藥性已演變為醫院感染和臨床治療的棘手問題。