氟尼藥典收載的水楊酸類藥物有水楊酸、水楊酸二乙胺、水楊酸鎂、阿司四林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯、二氟尼柳和雙水楊酯等。
一、性狀
阿司匹林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯和二氟尼柳的性狀描述見表1。
二、鑒別
(一)化學法
1.三氯化鐵反應此反應為酚羥基的反應,結構中含有酚羥基的藥物可利用本反應進行鑒別。
水楊酸類藥物在中性或弱酸性條件下,與三氯化鐵試液反應,生成紫色配合物。
此反應適宜的pH為4～6,在強酸性溶液中配位化合物分解。本反應極為靈敏,只需要取稀溶液進行試驗;若取樣量大產生顏色過深時,可加水稀釋后觀察。
對氨基水楊酸鈉加稀鹽酸呈酸性后,可與鐵離子形成紫紅色的配位化合物。貝諾酯需加氫氧化鈉試液煮沸,使酯水解,濾過,液加鹽酸適量至顯微酸性,然后加三氯化鐵試液,可顯紫色。阿司匹林需加熱水解生成水楊酸后才顯紫色,方法為:取本品約0.1g,加水10ml,煮沸放冷后,加三氯化鐵試液1滴,即顯紫堇色。
阿司匹林片和貝諾酯片可取細粉按原料藥方法直接鑒別。阿司匹林栓劑則需提取阿司匹林后再按原料藥方法鑒別,方法為:取本品適量(約相當于阿司匹林0.6g)加乙醇20ml,微溫使阿司匹林溶解,置冰浴中冷卻5分鐘并不斷攪拌,濾過濾液置水浴上蒸干,殘渣照原料的方法鑒別。
2.水解產物反應阿司匹林具有酯鍵,在堿性條件下水解后,生成水楊酸鈉和醋酸鈉。水楊酸鈉與游離水楊酸在水中溶解度明顯不同,可利用其溶解度差異觀察溶解與沉淀的現象;因醋酸有揮發性,酸化時可聞到醋酸臭味。方法為:取阿司匹林0.5g,加碳酸鈉試液10ml,煮沸2分鐘后,放冷,加過量的稀硫酸,即析出白色沉淀,并發生醋酸的臭氣。
若為阿司匹林片劑,加熱放冷后,應濾除片劑輔料等,再在濾液中進行酸化,否擾反應結果的觀察。
3.芳香第一胺類的鑒別反應 此反應為芳伯氨基或潛在芳伯氨基的反應,通常也稱為重氮化-偶合反應,即在酸性溶液中,具有此結構特征的藥物與亞硝酸試液發生重氮化反應生成重氮鹽,再與堿性B-萘酚試液偶合生成橙紅色沉淀。例如,對氨基水楊酸鈉具有芳伯氨基,而貝諾酯加酸發生水解反應后產生芳伯氨基,可用此反應進行鑒別貝諾酯的鑒別方法:取貝諾酯約0.1g,加稀鹽酸5ml煮沸,放冷,濾過,濾液加0.1mol/L亞硝酸鈉溶液數滴,滴加堿性B-萘酚試液數滴,生成橙紅色沉淀。
貝諾酯片可取片粉按原料藥方法直接鑒別。
(二)光譜法
1.紫外-可見分光光度法具有共軛雙鍵、苯環或芳雜環結構的藥物,在紫外可見光區有特征吸收,可用于定性鑒別。藥典采用紫外-可見分光光度法鑒別貝諾酯、二氟尼柳等。
(1)貝諾酯鑒別方法:取本品適量,精密稱定,無水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含7.5μg的溶液,照紫外一可見分光光度法測定,在240nm的波長處有最大吸收;在240nm的波長處測定吸光度,按干燥品計算,吸收系數(
)為730～760。
(2)二氟尼柳鑒別方法:取本品,加0.1mol/L鹽酸乙醇溶液溶解并稀釋制成1ml中含有20μg的溶液,照紫外-可見分光光度法測定,在251nm與的315nm的波長處有最大吸收,吸光度比值應為4.2～4.6。
2.紅外分光光度法 紅外分光光度法具有特征性強、專屬性好的特點,絕大多數藥物的原料藥均用紅外分光光度法鑒別,制劑由于輔料的干擾,一般不采用。藥典采用紅外分光光度法鑒別水楊酸、水楊酸鎂、阿司匹林、對氨基水楊酸鈉、貝諾酯、二氟尼柳等原料藥,要求供試品的紅外吸收光譜應與對照圖譜一致。
(三)色譜法
1.高效液相色譜法藥典采用高效液相色譜法鑒別阿司匹林片、腸溶片、腸溶膠囊、泡騰片,貝諾酯片及對氨基水楊酸鈉腸溶片,注射用對氨基水楊酸鈉等,要求在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。
2.薄層色譜法藥典采用薄層色譜法鑒別二氟尼柳膠囊。方法為:取內容物適量(約相當于二氟尼柳50mg),加甲醇5ml,振搖使二氟尼柳溶解,濾過,濾液做為供試品溶液;另稱取二氟尼柳對照品適量,用甲醇制成每1ml約含10mg的溶液,作為對照品溶液,照薄層色譜法試驗,吸取上述兩液各5μl,分別點于同一硅膠GF24薄層板上,以正己烷-二氧六環-冰醋酸(85:10:5)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外線燈(25nm)下檢視,供試品溶液所顯主斑點的位置和顏色應與對照品溶液的主斑點相同。
三、檢查
(一)特殊雜質檢查
1.阿司匹林及其制劑中特殊雜質檢查
(1)游離水楊酸:由于阿司匹林在合成過程中水楊酸的乙酰化反應不完全或在貯藏過程中水解而產生水楊酸,水楊酸對人體有一定毒性,且其分子中含有酚羥基,在空氣中易被氧化生成有色醌類化合物,如淡黃色、紅棕色甚至棕色,從而使阿司匹林變色,故需加以控制。藥典采用HPLC法檢查阿司四林及其制劑中的游離水楊酸。
阿司匹林中游離水楊酸的檢查方法:取本品約g,密稱定,置10ml量瓶中加冰酸甲醇溶液適量,振搖使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液(臨雨新制取水楊酸對照品約10mg,精密稱定,置100ml量瓶中,加1%冰醋酸甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置50ml量瓶中用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液;照高效液相色譜法試驗。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈—四氫呋喃—冰醋酸—水(20:5:5:70)為流動相:檢測波長為303nm理論板數按水楊酸峰計算不低于5000,阿司匹林峰與水楊酸峰的分離度應符合要求。立即精密量取供試品溶液、對照品溶液各10μl,別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,供試品溶液色譜圖中如有與水楊酸峰保留時間一致的色譜峰,按外標法以峰面積計算,不得過0.1%。水楊酸的雜質限量按式計算
式中,As為供試品溶液的峰面積;Ar為對照品溶液的峰面積;Ds為供試品溶液的稀釋倍數;Dr為對照品溶液的稀釋倍數;Vs為供試品溶液的定容體積;Vr為對照品溶液的定容體積;ms為供試品的稱樣量;mr為對照品的稱樣量。
由于阿司匹林在制劑過程中易水解生成水楊酸,因此藥典規定阿司匹林片腸溶片、腸溶膠囊、泡騰片及栓劑均照原料藥方法與色譜條件檢查水楊酸。
(2)有關物質:阿司匹林中有關物質系指除水楊酸以外的合成中引入的其他原料及副產物,如醋酸苯酯、水楊酸苯酯、乙酰水楊酸苯酯等。藥典采用高效液相色譜法的面積歸一化法檢查,以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-四氫呋哺-冰醋酸-水(20:5:5:70)為流動相A、乙腈為流動相B,梯度洗脫;檢測波長為276nm;以供試品溶液(10mg/ml)的稀釋液(0.5%)為對照溶液。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰,除水楊酸外,其他雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。
2.貝諾酯中特殊雜質的檢查
(1)游離水楊酸:藥典采用目視比色法檢查貝諾酯中的游離水楊酸。檢查的原理為利用貝諾酯結構中無酚羥基,不能與高鐵鹽作用,而水楊酸則可與高鐵鹽反應呈紫色,與一定量水楊酸對照溶液生成的色澤比較,從而控制游離水楊酸的限量。方法為:取本品0.1g,加乙醇5ml,加熱溶解后,加水適量,搖勻,濾入50ml比色管中,加水使成50ml,立即加新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml,搖勻,30鐘內如顯色,與對照液(精密稱取水楊酸0.1g,置1000ml量瓶中,加水溶解后,加冰醋酸1ml,搖勻,再加水適量至刻度,搖勻,精密量取1ml,加乙醇5ml與水44ml,再加上述新制的稀硫酸鐵銨溶液1ml,搖勻)比較,不得更深(0.1%)。
(2)對氨基酚:藥典采用靈敏度法檢查貝諾酯中的對氨基酚。其原理是利用對氨基酚堿性條件下能與亞硝基鐵氰化鈉生成藍色配位化合物,而貝諾酯無此反應。
取本品1.0g,加甲醇溶液(1→2)20ml,攪勻,加堿性亞硝基鐵氰化鈉試液1ml,搖勻,放置30分鐘,不得顯藍綠色。
(3)有關物質:貝諾酯中含有對乙氨基酚、乙撲熱息痛、阿司匹林、水楊酸等多種質。藥典采用HPLC法的自身稀釋對照法和雜質對照品法控制其限量。以十八烷烷鍵合硅膠為填充劑;以水(用磷酸調節pH至3.5)-甲醇(44:56)為流動相;檢測波長為240nm。以供試品溶液(0.4mg/ml)的稀釋液(1%)為對照液,以10μg/ml的對乙酰氨基酚為對照品溶液,規定供試品溶液的色諧圖中如有與對照品溶液主峰保留時間一致的色譜峰,其峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.1倍;其他單個雜質峰面積均不得大對照溶液主峰面積的0.5倍;各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積。
3.對氨基水楊酸鈉中有關物質的檢查
對氨基水楊酸鈉一般以間氮基酚為原料進行合成,致使對氨基水楊酸鈉中可能引入間氨基酚及反應副產物。間氨基酚不僅有,而且易被氧化變色,故藥典采用HPLC法控制有關物質的限量。
(二)制劑檢查
貝諾酯片溶出度的測定貝諾酯不溶于水,體內吸收受到溶解速度的影響,因要測定其溶出度。藥典采用紫外-可見分光光度法測定貝諾酯片的溶出度。
測定方法:取本品,照溶出度測定法(第二法),以1%十二烷基硫酸鈉溶液1000mL為溶出介質,轉速為每分鐘90轉,依法操作、經45分鐘時,取溶液10m,濾過,精密量取續濾液適量;用水稀釋制成每1ml中含有貝諾酯8g的溶液,作為供試品溶液;另取貝諾對照品20mg,精密稱定,置50ml量瓶中,加無水乙醇溶解并稀釋至刻度,播勻,精密量取2ml至100ml量瓶中,用溶出介質稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液。取上述兩種溶液,照紫外一可見分光光度法,在240mm的波長處分別測定吸光度,計算每片的溶出量。限度為標示量的65%,應符合規定。每片的溶出量按式計算
式中,As為供試品溶液的吸光度;Ar為對照品溶液的吸光度;Ds為供試品溶液的稀釋倍數;Dr為對照品溶液的稀釋倍數100/2=50;V介質為溶出介質的體積1000ml;Vr為對照品溶液的定容體積50ml;mr為對照品的稱樣量。
2.釋放度的測定 釋放度系指口服藥物從緩釋制劑、控釋制劑,腸溶制劑及透皮劑等在規定溶劑中釋放的速度和程度。阿司匹林腸溶片、腸溶膠囊需進行釋放度的測定。
例如,藥典中阿司匹林腸溶片的釋放度測定方法如下。
酸中釋放量取本品,照釋放度測定法,采用溶出度測定法第一法裝置,以0.1mol酸溶液600ml(25mg規格)為溶出介質,轉速為每分鐘100轉,依法操作,經2小時后取溶液10ml,濾過,取續濾液作為供試品溶液;取阿司匹林對照品,精密稱定,加1%冰酸甲醇溶液溶解并稀釋制成4.25μgml(25mg規格)的溶液,作為對照品溶液。照含量定項下方法測定。計算每片中阿司匹林的釋放量,限度應小于阿司匹林標示量的10%緩沖溶液中釋放量在酸中釋放量檢查項下的溶液中繼續加入37℃的0.2 mol/l溶液2u5mg規格),混勻,用2mol/L鹽酸溶液或2mL氫氧化鈉溶液調節溶液的pH為6.8±0.05,繼續溶出45分鐘,取溶液10ml,濾過,取續濾液作為供試品溶液。
另取阿司匹林對照品適量,精密稱定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋制成22μg/ml(25mg規格)的溶液,作為阿司匹林對照品溶液;另取水楊酸對照品,精密稱定,用1%冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋制成1.7μg/ml(25mg規格)的溶液,作為水楊酸對照品溶液。照含量測定項下色譜條件,精密量取供試品溶液、阿司匹林對照品溶液與水楊酸對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按外標法計算出每片中阿司匹林和水楊酸的含量,將水楊酸含量乘以1.034后,與阿司匹林含量相加即得每片緩沖溶液中的釋放量。限度為標示量的70%。
四、含量測定
(一)酸堿滴定法
阿司匹林結構中游離羧基的酸性,其電離常數為3.27×10-4,可采用標準堿滴定液直接滴定。
測定方法:取本品約0.4g,精密稱定,加中性乙醇(對酚酞指示液顯中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴,用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/)滴定。每1ml氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)相當于18.02mg的C9H8O4。按干燥品計算,含C9H8O4不得少于99.5%。
阿司匹林具有酯的結構,為了使阿司匹林易于溶解并防止其酯鍵在滴定時水解而致使測定結果偏高,故不用水為溶劑,而選用中性乙醇溶液溶解供試品。本品屬于弱酸,用強堿滴定時,化學計量點偏堿性,故指示劑選用在堿性區變色的酚酞。滴定時應在不斷振搖下稍快地進行,以防止局部堿度過大而促使其水解。試驗表明當溫度在0～40℃時,對測定結果幾乎沒有影響。供試品中所含水楊酸超過規定限度時,不宜用直接滴定法測定。
(二)紫外-可見分光光度法
本類藥物的結構中有共軛系統,具有紫外吸收,可采用紫外-可見分光光度法測定其含量。
(三)高效液相色譜法
為了分離原料藥的制劑中的雜質、輔料及穩定劑等,藥典采用高效液相色譜中的外標法測定阿司匹林各種制劑、對氨基水楊酸鈉及其制劑、貝諾酯及其片劑的含量。
例如,阿司匹林片的含量測定方法為:取本品20片,精密稱定,充分研細,精密稱取細粉適量(約相當于阿司四林10mg),置100ml量瓶中,用1%冰醋酸甲醇溶液強烈振搖使阿司匹林溶解,并用1%冰醋酸甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻濾膜濾過,精密量取續濾液10μ注入液相色譜儀,記錄色譜圖。另取阿司匹林對照品,精密測定,加1%冰醋酸溶液振搖使溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.g的溶液,同法測定。按外標法以峰面積計算,即得。阿司匹林片標示量的百分含量按式阿司匹林片標示量%=計算:
式中,Cr為對照品溶液的濃度;Ar為對照品峰面積;AS為供試品峰面積;D為稀釋倍數,1;V為定容體積,100ml;ms為供試品的取樣量(g)。
五、其他水楊酸類藥物的質量檢測
除上述介紹的藥物外,《中國藥典》二部還收載了其他水楊酸類藥物,其檢測項目與方法各異。