對于利用rRNA的熒光原位雜交來說，如下原因可導致較低的熒光信號強度：
較低的細胞核糖體含量
較低的細胞周邊的通透性
較低的目標序列可接觸性（由于rRNA的折疊產生的構象，有些位置與rRNA分子內其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸，從而使探針無法和目標序列雜交）
為檢驗細胞中的目標序列是否容易被探針雜交，及測試最佳雜交溫度，可利用“克隆熒光原位雜交”(clone-FISH)進行試驗：將rRNA基因結合入質粒，轉化至大腸桿菌中表達，構成核糖體，再用熒光標記的探針雜交。
FISH可與流式細胞術聯用，對特定熒光標記的細胞進行計數或者分離。